猪3型腺病毒的分离与鉴定

发布时间：2017-04-14 06:20

  本文关键词：猪3型腺病毒的分离与鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪3型腺病毒(PAdV-3)为嗜肠道型病毒,由于具有严格的宿主特异性,对猪无明显的致病性,不需要额外的佐剂便可诱导较强的体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫,可用于大规模生产,因此PAdV-3是理想的疫苗载体。目前,猪3型腺病毒和猪5型腺病毒都已获得全序列,已被应用于载体疫苗并取得较好效果。为获得猪3型腺病毒用于载体疫苗研究,本论文采集健康猪肠内容物通过ST细胞进行病毒分离培养并对分离毒株的关键基因p IX、hexon进行测序和分析,获得如下结果:1.利用ST细胞连续传代后,分离得到猪腺病毒毒株BJ14株(北京),Ben23、Ben29、Ben30、Ben33株(陕西)。2.对以上分离到的5株猪腺病毒hexon保守区序列(巢式PCR产物)、三株(Ben29、Ben30、Ben33)全长hexon基因及Ben30株的全长p IX基因进行进行扩增、克隆和测序。同时用DNAStar、Clone Manager将其与GeneBank中登录的猪3型腺病毒毒株(IAF、6618、PAdV-3)的hexon、pIX序列进行序列变化、遗传进化关系、抗原位点分析。(1)通过对五个毒株的巢式PCR产物的序列比对分析后发现,本实验室分离的五个毒株(Ben23、Ben29、Ben30、Ben33、BJ14)相互间的同源性在98.2%—99.7%之间。这5个毒株与与6618、IAF、PAV-3的同源性均在98.2%以上;与其他猪腺病毒的同源性在76%以下。(2)实验室毒株Ben29、Ben30、Ben33 hexon基因核苷酸序列分析表明:Ben33、Ben29、Ben30的同源性达81.6%以上;Ben29、Ben30与IAF、6618的同源性达99.5%以上;Ben33与IAF、6618的同源性达81.2%以上。(3)通过抗原表位预测软件预测发现:实验室毒株Ben29、Ben30、Ben33与6618毒株的hexon抗原优势表位相同,与PAdV-5的hexon抗原优势表位存在较大差异。(4)通过对实验室毒株Ben30与6618毒株、IAF毒株、PAV-3毒株的pIX基因的序列比对分析发现,Ben30的pIX的氨基酸与GenBank上公布的IAF毒株、6618毒株、经典毒株相应的片段比较,同源性达91%。综合以上研究,本论文在国内分离到猪3型腺病毒3株,研究结果可为进一步进行猪3型腺病毒感染性克隆的构建以及对猪3型腺病毒进行分子生物学的研究奠定基础。
【关键词】：猪3型腺病毒 pIX hexon基因 遗传进化分析
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 文献综述9-15
• 第一章 猪腺病毒的概述9-15
• 1.1 腺病毒的分子特征与基因组结构特点9-11
• 1.1.1 腺病毒的分子特征9
• 1.1.2 腺病毒的基因组结构9-11
• 1.1.2.1 E1基因9-10
• 1.1.2.2 E2基因10
• 1.1.2.3 E3基因10-11
• 1.1.2.4 E4基因11
• 1.1.2.5 ITR11
• 1.2 流行病学11-12
• 1.2.1 易感动物11-12
• 1.2.2 传染源12
• 1.2.3 传播途径12
• 1.2.4 流行特点12
• 1.3 猪腺病毒的诊断12
• 1.3.1 血清学诊断12
• 1.3.2 分子生物学检测12
• 1.4 猪腺病毒裁体的研究现状12-15
• 1.4.1 猪3型腺病毒载体的构建13
• 1.4.2 猪3型腺病毒作为表达载体的研究进展13-15
• 试验研究15-33
• 第二章 猪3型腺病毒的分离与鉴定15-33
• 2.1 材料15-17
• 2.1.1 载体、细胞、菌株15
• 2.1.2 主要药品及试剂15
• 2.1.3 溶液配制15-16
• 2.1.3.1 培养基及电泳相关溶液15-16
• 2.1.3.2 细胞培养基及相关溶液16
• 2.1.4 主要仪器16-17
• 2.2 方法17-20
• 2.2.1 病料的收集与处理17
• 2.2.2 PCR引物设计17
• 2.2.3 病毒DNA的提取17-18
• 2.2.4 巢式PCR检测18
• 2.2.5 PAdV-3 病原分离18
• 2.2.6 分离毒株DNA的提取18
• 2.2.7 猪3型腺病毒hexon、pIX序列的扩增18-19
• 2.2.8 目的片段的获得19
• 2.2.9 目的片段的连接19-20
• 2.2.10 转化20
• 2.2.11 菌液PCR鉴定20
• 2.2.12 基因测序20
• 2.2.13 测序结果的处理与分析20
• 2.3 结果20-31
• 2.3.1 Nested-PCR检测结果20-21
• 2.3.2 病原分离21
• 2.3.3 PCR扩增hexon、p IX基因21-22
• 2.3.4 重组质粒的PCR鉴定22-23
• 2.3.5 巢式PCR扩增出的目的基因测序结果的分析23-28
• 2.3.5.1 分离毒株Ben23巢式PCR产物测序结果的分析23-24
• 2.3.5.2 分离毒株Ben29巢式PCR产物测序结果的分析24-25
• 2.3.5.3 分离毒株Ben30巢式PCR产物测序结果的分析25
• 2.3.5.4 分离毒株Ben33巢式PCR产物测序结果的分析25-26
• 2.3.5.5 分离毒株BJ14巢式PCR产物测序结果的分析26
• 2.3.5.6 巢式PCR产物遗传变异分析26-28
• 2.3.6 hexon基因核苷酸序列分析及发育系统分析28-29
• 2.3.7 hexon基因的抗原性分析29-30
• 2.3.8 PCR扩增出的pIX基因测序结果分析30-31
• 2.4 讨论31-32
• 2.5 小结32-33
• 结论33-34
• 参考文献34-37
• 缩略词表37-38
• 致谢38-39
• 作者简介39

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本文编号：305399