犏牛雄性不育相关蛋白筛选研究

发布时间：2017-04-14 03:08

  本文关键词：犏牛雄性不育相关蛋白筛选研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：犏牛的雄性不育是由于精子发生阻滞造成的,由此导致牦牛育种中无法对犏牛杂合优秀基因的有效利用,在研究犏牛精子发生阻滞机制机理方面,虽然前人已经做了一些工作,但是犏牛和牦牛之间睾丸蛋白质比较组学的研究尚未报道,因此在睾丸蛋白组学水平筛选可能导致犏牛精子发生阻滞的重要蛋白并深入研究其功能具有重要的生殖生物学基础理论意义。本研究应用iTRAQ方法对牦牛和犏牛睾丸蛋白组进行比较研究,鉴定出了256个显著差异表达蛋白,其中大量上调蛋白可能参与多种应激反应(特别是炎症性应激)、增强生精细胞间黏附性或抑制生精细胞向曲细精管官腔的迁移,而许多下调蛋白主要与精子发生中多种细胞代谢缺陷和细胞分化过程有关,这项研究发现的很多重要蛋白可能与犏牛精子发生阻滞相关,这些蛋白将对犏牛精子发生阻滞分子机制的深入研究提供重要信息和切入点。主要研究结果如下:1.从犏牛和牦牛睾丸组织切片可以看出,犏牛睾丸曲细精管外膜萎缩且不规整,可能是由细胞凋亡引起的。在牦牛曲细精管中,从基底膜到管腔分布有各级生精细胞,包括精原细胞、精母细胞、圆形或长形精子细胞。然而,在犏牛曲细精管中,基底膜只分布有单层的精原细胞,精母细胞数量较少,几乎没有圆形或长形精子细胞。2.在犏牛和牦牛睾丸表达差异蛋白中,排在前四位的上调蛋白是PTX3,S-100,H1.0和Osteoglycin,其差异倍数分别为3.8,3.5,3.1和2.9,相比之下,排在前四位下调蛋白是MHC class II,Ropporin-1,SNRPF protein和Protamine 2,差异倍数分别为-6.9,-4.7,-4.5和-4.2。3.大量上调蛋白可能参与多种应激反应(特别是炎症性应激)、增强生精细胞间黏附性或抑制生精细胞向曲细精管管腔的迁移。一些高表达蛋白(ICAM1,微纤丝相关糖蛋白4(MFAP4),胰岛素样生长因子结合蛋白前体7(IGFBP7),Dermatopontin(DPT),整合素α9(ITGA9),整合素β1(ITGB1)可以提高细胞的粘附力,阻碍生殖细胞从基底膜脱离向生精小管管腔内迁移。4.许多下调蛋白与精子发生过程中各种代谢过程和细胞过程的缺陷有关。PIWIL1和TDRD1表达下降可能影响PIWI或piRNA在保护生殖细胞基因组的完整性的功能;Gpx4在精母细胞中耗竭,引起精子严重异常,这可能也是雄性不育的原因;线粒体细胞色素BC1复合体亚基2、7和9的下调,与阿尔茨海默病的途径和氧化磷酸化有关,这可能会导致线粒体功能障碍和犏牛睾丸生殖细胞凋亡;PSME4是一种大量表达的核蛋白,PSME4的缺失,导致雄性生育能力明显下降,总之,参与各种代谢过程的蛋白表达下调可能导致精子发生阻滞。5.本研究通过对465个差异表达蛋白在KEGG数据库通路富集,共获得了15个显著富集通路,其中排在前五的是细胞外基质受体相互作用(P=0.0003843598),蛋白质的消化和吸收(P=0.0007844198),阿尔茨海默氏病(P=0.002146642),核糖体(P=0.004046523)和磷酸戊糖通路(P=0.006084241)。在细胞外基质受体相互作用通路中,整合素及其配体的过表达(细胞外基质)可能有助于生精细胞耐受拉力而不被牵离。通过对阿尔茨海默病和氧化磷酸化通路的综合分析表明,诸如线粒体细胞色素BC1复合体亚基等蛋白的下调可能导致犏牛睾丸细胞线粒体功能障碍和细胞凋亡。6.本研究同样采用iTRAQ方法研究不同发育阶段的犏牛睾丸蛋白组的差异(P1-10月龄,P2-12月龄,P3-14月龄)。P2与P1阶段相比,蛋白质组分析鉴定出318个差异表达蛋白,P3与P1阶段相比,共有327个差异表达蛋白。P2与P1,P3与P1相比,差异表达的蛋白GO注释并没有明显的差异,这可以归因于它们的早期发育过程中的犏牛睾丸生精就受到阻滞。另一方面,P2,P3与P1阶段相比,有56共同差异表达的蛋白,大部分蛋白与催化、分子转运、氧化还原酶和蛋白结合相关。进一步分析表明,差异表达的蛋白包括HBPs,Tudor domain containing 1,HSPA2,17_HSDXI,2,4-dienoyl-CoA reductase和Prx2可能与睾丸发育和精子发生相关,可作为候选蛋白在今后的研究中揭示犏牛雄性不育分子机制。
【关键词】：犏牛 牦牛 睾丸 蛋白质组 犏牛精子发生阻滞
【学位授予单位】：西南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-14
• 1 绪论14-21
• 1.1 犏牛的基本概况及其研究现状14-17
• 1.1.1 犏牛的基本概况14-15
• 1.1.2 犏牛雄性不育机制研究现状15-17
• 1.2 蛋白质组学研究概况17-20
• 1.2.1 蛋白质组学概念及主要研究内容17
• 1.2.2 蛋白质组学主要技术17-18
• 1.2.3 蛋白质组学研究的新技术18
• 1.2.4 iTRAQ定量蛋白质组学原理18-19
• 1.2.5 iTRAQ技术的优势19-20
• 1.3 犏牛雄性不育研究目的和意义20-21
• 2 犏牛和牦牛睾丸解剖组织结构研究21-27
• 2.1 实验材料21-22
• 2.1.1 动物样品的采集21
• 2.1.2 主要仪器与设备21-22
• 2.1.3 主要试剂及配制22
• 2.2 方法22-23
• 2.3 结果与分析23-25
• 2.4 讨论25-27
• 3 犏牛与牦牛睾丸蛋白组学比较分析27-65
• 3.1 实验材料27-29
• 3.1.1 实验动物睾丸组织的采集27
• 3.1.2 主要仪器设备27-28
• 3.1.3 主要工具酶及试剂28-29
• 3.2. 方法29-36
• 3.2.1 睾丸组织蛋白提取29-30
• 3.2.2 蛋白质浓度Bradford定量30
• 3.2.3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳30-31
• 3.2.4 蛋白质酶解31
• 3.2.5 iTRAQ标记31-32
• 3.2.6 强阳离子交换色谱（Strong Cation Exchange chromatographic, SCX）分离32
• 3.2.7 基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MSMS分析32-33
• 3.2.8 标准生物信息分析流程33-34
• 3.2.9 犏牛雄性不育相关蛋白表达水平的ELISA分析方法34-36
• 3.2.10 ELISA实验数据处理36
• 3.3 结果与分析36-61
• 3.3.1 蛋白定量结果36-38
• 3.3.2 显著差异蛋白统计38
• 3.3.3 蛋质丰度分布结果38-40
• 3.3.4 犏牛和牦牛睾丸组织中差异表达蛋白统计分析40-47
• 3.3.5 差异表达蛋白的功能分析47-49
• 3.3.6 差异表达蛋白GO分析49-56
• 3.3.7 差异表达蛋白的Pathway富集分析56-59
• 3.3.8 相关差异表达蛋白表达水平的ELISA分析59-61
• 3.4 讨论61-65
• 3.4.1 在犏牛睾丸中上调的蛋白质可能导致生精小管结构异常61-62
• 3.4.2 直接参与精子生成过程的调节蛋白62-63
• 3.4.3 一些可能与多种应激相关的差异蛋白63
• 3.4.4 在精子发生过程中，有可能与生精细胞代谢缺陷相关的蛋白63-64
• 3.4.5 相关差异表达蛋白的ELISA验证64-65
• 4 犏牛不同发育阶段（P1，，P2，P3）的差异表达蛋白比较分析65-78
• 4.1 实验材料65
• 4.1.1 实验动物睾丸组织的采集65
• 4.1.2 主要仪器与设备65
• 4.1.3 主要工具酶及试剂65
• 4.2 方法65-66
• 4.3 结果与分析66-75
• 4.3.1 不同发育阶段的差异表达蛋白66-69
• 4.3.2 与P1相比，P2和P3阶段共同差异表达蛋白69-72
• 4.3.3 与P1相比，在P2和P3阶段共同差异表达蛋白的功能分析72-75
• 4.4 讨论75-78
• 结论78-79
• 致谢79-80
• 参考文献80-88
• 攻读学位期间发表的与学位论文内容相关的学术论文及研究成果88

  本文关键词：犏牛雄性不育相关蛋白筛选研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：305063