山东H9N2亚型禽流感病毒对α-2,6唾液酸受体亲和性变化及血凝素蛋白糖基化对病毒致病性影响的研究

发布时间：2017-04-13 20:06

  本文关键词：山东H9N2亚型禽流感病毒对α-2,6唾液酸受体亲和性变化及血凝素蛋白糖基化对病毒致病性影响的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禽流感(Avian influenza AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus type A)引起的一种传染性疾病,根据致病性的强弱可以分为高致病性禽流感(HPAIV)和低致病性禽流感(LPAIV)。流感病毒基因由8个片段组成,其中血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)是病毒的主要囊膜糖蛋白。流感病毒感染宿主始于HA蛋白和宿主细胞上的受体结合,HA蛋白主要结合两种形式唾液酸即:α-2,3唾液酸乳糖和α-2,6唾液酸乳糖。不同宿主的唾液酸的类型不同在一定程度上决定了流感病毒感染宿主的不同。迄今为止,已经发现H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽类,也可以可感染哺乳动物包括小鼠、豚鼠、雪貂、灵长类。血清学调查发现我国养殖从业人员血清中H9N2流感病毒抗体的阳性率达2.3%-13.7%,这表明H9N2亚型禽流感病毒已经获得跨越种间屏障感染哺乳动物甚至是人的能力,因而具有引发新的流感大流行的潜在威胁。H9N2亚型AIV可以为新发流感病毒提供供体,如1997年香港流行的H5N1亚型流感病毒,其内部基因可能来源于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分离株。2013年流行的H7N9亚型AIV的内部基因有6个来自H9N2亚型AIV。因此,加强对H9N2亚型AIV对人源受体亲和性变化的检测以及病毒对哺乳动物致病机制研究具有重要的公共卫生意义。本研究对2001-2013间分离的12株H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析发现:12株AIV尽管都属于Y-280这一大分支,但是又可以分为4个小的分支,这表明H9N2亚型禽流感病毒也在发生变异,尽管变异速度没有H5亚型禽流感那么快速。固相结合试验结果表明:不同的分离年代H9N2亚型AIV对α-2,6唾液酸受体的亲和能力存在差异,总的趋势是:随着分离年代临近,病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和能力逐渐增强,其中2013年分离株(A/Chicken/Shandong/903,简称CK/SD/903)对α-2,6唾液酸受体的亲和性最强,2006年分离株(A/Chicken/Shandong/274,简称CK/SD/274)对α-2,6唾液酸受体的亲和性最弱。通过对CK/SD/903和CK/SD/274这两个模型毒株的HA蛋白糖基化位点进行比较发现:CK/SD/903的血凝素蛋白分别在200和295位比CK/SD/274多了两个N-糖基化位点,为了验证这两个位点糖基化是否影响病毒对α-2,6受体唾液酸受体亲和性,我们构建了CK/SD/903的8质粒反向遗传操作系统,并且对CK/SD/903的血凝素蛋白的200和295位氨基酸进行突变,得到2个突变病毒。固相结合试验结果表明HA N200Q(200位由N变为Q),而HA N295Q(295位由N变为Q)可以减弱病毒对α-2,6受体唾液酸受体亲和性。为了进一步验证这两个位点的糖基化是否影响病毒对哺乳动物致病性,分别用106EID50的野毒和突变病毒(CK/SD/903(HA N200Q),CK/SD/903和CK/SD/903)攻毒6周龄小白鼠。攻毒试验结果表明:HAN200Q(200位由N变为Q)后,尽管突变病毒对小鼠的体重没有明显影响,但是可以提高病毒在小白鼠肾脏等器官复制能力(病毒基因相对表达量是野毒的936.32倍);HA N295Q(295位由N变为Q)突变后,可以提高病毒在小白鼠肝脏等器官的复制能力(病毒基因相对表达量是野毒的56倍)。本研究系统的研究了2001-2013年间的12株H9N2亚型禽流感病毒HA基因进化和病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性,结果表明:H9N2亚型流感禽流感病毒存在一定程度变异,尽管不如H5亚型流感那么明显;随着分离年代临近,病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性逐渐增强。利用反向遗传操作技术验证了903毒株HA蛋白200和295位糖基化影响病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性变化,并且这两个位点糖基化能够影响病毒对小白鼠组织嗜性。这为阐明H9N2亚型流感病毒跨种间传播的分子遗传机制提供重要的理论和实验依据,并且能够为H9N2亚型流感病毒感染哺乳动物或者人提供预警,因此本研究具有重要的兽医指导意义和公共卫生意义。
【关键词】：禽流感 受体亲和性 糖基化位点 致病性
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要9-11
• Abstract11-13
• 1 前言13-25
• 1.1 流感病毒的流行史13-15
• 1.2 流感病毒结构及感染宿主细胞的过程15-19
• 1.2.1 流感病毒的结构15-17
• 1.2.2 病毒粒子与宿主细胞受体的结合17-18
• 1.2.3 病毒粒子进入宿主细胞18
• 1.2.4 病毒核糖核蛋白（vRNP）的入核18
• 1.2.5 病毒基因组的转录和复制18-19
• 1.2.6 核糖核蛋白的出核19
• 1.2.7 病毒粒子的组装和释放19
• 1.3 流感病毒受体19-24
• 1.4 糖基化对病毒受体亲和性和致病性的影响24
• 1.5 本研究的目的意义24-25
• 2 材料与方法25-39
• 2.1 试验材料25-26
• 2.1.1 试验毒株及载体25
• 2.1.2 试验动物25
• 2.1.3 主要试剂25
• 2.1.4 试验仪器25-26
• 2.1.5 主要试剂的配置26
• 2.2 试验方法26-39
• 2.2.1 12株病毒HA基因的克隆测序及遗传进化分析26-29
• 2.2.2 固相结合试验分析禽流感病毒受体亲和性的变化趋势29-30
• 2.2.3 CK/SD/903反向遗传操作系统的构建30-34
• 2.2.4 点突变质粒的构建与点突变病毒的拯救34-36
• 2.2.5 CK/SD/903和突变病毒生物学特性分析36-39
• 3 结果39-48
• 3.1 H9N2亚型禽流感病毒氨基酸序列分析39
• 3.2 H9N2亚型禽流感病毒遗传进化分析39-41
• 3.3 固相结合试验分析受体亲和性变化趋势41-42
• 3.4 CK/SD/903病毒反向遗传操作系统的构建42-44
• 3.5 点突变质粒的构建以及糖基化位点验证44-45
• 3.5.1 点突变质粒构建及突变病毒的拯救44
• 3.5.2 SDS-PAGE验证突变病毒和野毒糖基化位点44-45
• 3.6 突变病毒受体亲和性变化及致病性试验45-48
• 3.6.1 突变病毒受体亲和性变化45-46
• 3.6.2 突变病毒对SPF胚和小白鼠的致病性46-47
• 3.6.3 利用荧光定量分析病毒在小白鼠内脏器官基因的相对表达量47-48
• 4 讨论48-52
• 5 结论52-53
• 参考文献53-60
• 致谢60-61
• 附录61-62
• 攻读硕士期间发表的文章62

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7 ;科学与禽流感之间的战争[J];科技资讯;2004年05期

8 ;我国禽流感病毒研究新发现[J];中国牧业通讯;2005年19期

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1 孙晓林;;禽流感和公共卫生[A];中国畜牧兽医学会兽医病理学分第12次暨中国动物病理生理学专业委员会第11次学术讨论会论文集[C];2003年

2 何义林;叶冬青;;禽流感病毒对人类感染机制的研究进展[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

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6 黄志坚;陈强;李清禄;王寿昆;江和基;;不同消毒剂对禽流感病毒的杀灭试验[A];福建省科协第八届学术年会分会场“转变饲养方式，促进海西畜牧业和谐发展”学术年会论文集[C];2008年

7 周祖华;张敏;程礼明;徐彬;沈彩信;;禽流感流行趋势分析[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

8 王志宇;张议文;刘桂林;;禽流感病毒的分子生物学研究进展[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年

9 刘迎芳;饶子和;;禽流感病毒(H5N1)RNA聚合酶PA亚基相关三维晶体结构与功能分析[A];第十一次中国生物物理学术大会暨第九届全国会员代表大会摘要集[C];2009年

10 韦婷;胡杰;兰彬;陆文俊;苏凯;覃芳芸;;广西暴发中低毒力禽流感情况报告[A];中国畜牧兽医学会禽病学会分会第十次学术研讨会论文集[C];2000年

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1 农业部动物疫病诊断与流行病学中心主任 崔尚金 博士;候鸟发生禽流感给我们的警示[N];中国畜牧兽医报;2005年

2 莫书莹;世卫警告：禽流感或大流行全球经济应警惕[N];第一财经日报;2005年

3 本报记者 魏红欣;禽流感“啄”痛全球经济[N];国际金融报;2005年

4 本报记者　许凯;狙击禽流感：一场鸟与人的战争[N];国际金融报;2005年

5 新华社记者　杨爱国;防控禽流感需要加强国际合作[N];光明日报;2005年

6 李杨;禽流感疫情不会长期影响农产品期价[N];金融时报;2005年

7 罗政、夏文辉;香港强化防止禽流感措施[N];人民日报海外版;2004年

8 本报记者　张向永　赵秀芹;禽流感让全世界手牵手[N];市场报;2005年

9 ;禽流感病毒能否绝迹？[N];中国石油报;2004年

10 何源;严防禽流感从境外传入我国[N];中国食品质量报;2005年

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1 邹镇;H5N1型禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒致急性呼吸损伤的机理研究[D];北京协和医学院;2012年

2 赵蔚;基于磁分离和荧光量子点标记的高灵敏禽流感病毒检测[D];武汉大学;2012年

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5 樊兆斌;野鸟源禽流感病毒(AIV)分离株的遗传进化及其致病性研究[D];东北林业大学;2014年

6 桑晓宇;H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠模型中水平传播的分子机制研究[D];中国农业科学院;2015年

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7 孟芳;H9N2亚型禽流感HA基因演化及其内部基因在H5N2亚型流感病毒演化中的作用[D];山东农业大学;2015年

8 韩雯;山东地区H9N2禽流感流行病学调查及流行毒株分子生物学检测[D];山东农业大学;2014年

9 查国飞;昆虫细胞表达重组H5亚型禽流感HA蛋白及其免疫原性研究[D];安徽农业大学;2014年

10 侯群;新疆青格达湖湿地鸟类中H5、H7亚型AIV和NDV流行病学监测[D];石河子大学;2015年

  本文关键词：山东H9N2亚型禽流感病毒对α-2,6唾液酸受体亲和性变化及血凝素蛋白糖基化对病毒致病性影响的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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