西北部分地区牛源分枝杆菌的分离鉴定及耐药性分析
发布时间：2021-03-06 22:25
结核病是流行于世界各地、严重威胁人和动物健康的一类人畜共患传染病。牛作为人类生产生活资料的重要来源,在结核病的传播过程中有着重要地位。本研究对分离自宁夏和新疆为主的西北部分地区规模化奶牛场中PPD阳性奶牛的疑似致病菌,采用多位点PCR进行菌种鉴定。利用MIRU-VNTR基因分型技术探究牛源分离株的基因型。经过药物敏感试验了解牛源分离株的表型耐药情况。通过对耐药基因测序,研究耐药菌株耐药基因突变与表型耐药和基因型之间的相关性。运用基因测序技术,探究西北五省非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacterium,NTM）的种类,为西北地区控制牛结核病提供可靠的理论依据。采用酸性罗氏无淀粉培养基对82株结核病疑似致病菌的冻存菌株进行复壮和传代培养,最终成功复壮80株分离株。经16SrRNA初步鉴定,80株临床分离株均属于分枝杆菌属。通过MPT64基因和多位点PCR鉴定出30株MTBC,其中一株为宁夏株,其余29株分离株均为新疆株。采用比例法进行一线抗结核药物（异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇）敏感试验,20株（20/30,66.7%）结核分枝杆菌对四种一线抗结核药均敏感,...
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－２?１９９５－２０１７年全球范围内的肺结核耐药监测数据（ＷＨＯ?２０１７年报告）［３］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｇｌｏｂａｌ?ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ?ｄａｔａ?ｏｎ?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ?ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｄｕｒｉｎｇ?ｐｅｒｉｏｄ?１９９５－２０１７?（ＷＨＯ?２０１７?ｒｅｐｏｒｔ）?＾??１．１牛结核病流彳Ｔ特征研咒??根据报道，在全球范围内大约１５％结核病人是因为饮用结核病牛生产的牛奶而受?
１．３．４?ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ?分型技术??ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ技术的基本原理就是基于同一位点的不同的串联重复拷贝数，并且同一菌株中??不同位点的拷贝数不同对菌株进行基因分型【６Ｓ】（如图１－４）。该基因分型是在真核生物中常用的方??法，具有操作简单、所需样本量少、分辨力髙、稳定性和重复性好、结果易于数字化等优点，便??于全球不同实验室进行结果比较［３７】，对于ＩＳ６１１０拷贝数很低的菌株也有很高的分型能力［６９］，是目??前最有前景的分型方法［７（Ｋ７２１。１９９７年，Ｓｕｐｐｌｙ等对ＢＣＧ和Ｍ?？ｗＺ）ｅｒｃｗ／ｏ＾ｓｅｎＸ３－ｒｅｇＸ３基因序列进??行比较分析，证实不同结核分枝杆菌的基因组中都存在多个相似的重复序列［７３］。通过对Ｈ３７ＲＶ进??行全基因组序列分析，发现了?４１个ＭＩＲＵ位点。通过设计特异性引物对４１个ＭＩＲＵ位点进行ＰＣＲ扩??增再进行测序分析，发现其中的１２个位点具有多态性，因此可作为ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ基因分型的依据??［叫。??采用ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ技术对结核分枝杆菌临床株进行基因分型的过程中
ｐ、：＿＊；！??Ｉ?ｉｆｆ［??图２－１结核分枝杆菌临床分离株Ｌ－Ｊ培养结果??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?Ｌ－Ｊ?ｃｕｌｔｕｒｅ?ｏｆ?ｃｌｉｎｉｃａｌ?ｉｓｏｌａｔｅｓ?ｏｆ?Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ??２．３．３?ＤＮＡ提取结果??经ＮａｎｏＤｒｏｐ?８０００检测提取的ＤＮＡ浓度和纯度。经过检测，采用柱式分枝杆菌核酸提取试??剂盒提取的ＤＮＡ纯度较高，浓度较低。采用双蒸水或者ＴＥ缓冲液将提取的ＤＮＡ稀释成合适的??工作浓度，并置于－２０°Ｃ冰箱内保存备用。??２．３．４?ＰＣＲ鉴定结果??８０株临床分离株均扩增出阳性条带（如图２－２）。??图２－２部分临床分离株扩增结果??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?１６ＳｒＲＮＡ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｓｏｍｅ?ｃｌｉｎｉｃａｌ?ｉｓｏｌａｔｅｓ??注：Ｍ：２０００ｂｐ?ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；?１：阴性对照；２：阳性对照（标准株Ｈ３７Ｒｖ）；?３－１１：临床分离株；１２：空白对照；目的片段：５４３ｂｐ??２．３．５?测序结果??将７沾测序结果在ＮＣＢＩ上进行ＢＬＡＳＴ比对，一致性均为１００％，表明该８０株临床分??离株均属于分枝杆菌属。??－１５－??
本文编号：3067927
【文章来源】：宁夏大学宁夏回族自治区 211工程院校
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－２?１９９５－２０１７年全球范围内的肺结核耐药监测数据（ＷＨＯ?２０１７年报告）［３］??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｇｌｏｂａｌ?ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ?ｄａｔａ?ｏｎ?ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ?ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ?ｄｕｒｉｎｇ?ｐｅｒｉｏｄ?１９９５－２０１７?（ＷＨＯ?２０１７?ｒｅｐｏｒｔ）?＾??１．１牛结核病流彳Ｔ特征研咒??根据报道，在全球范围内大约１５％结核病人是因为饮用结核病牛生产的牛奶而受?
１．３．４?ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ?分型技术??ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ技术的基本原理就是基于同一位点的不同的串联重复拷贝数，并且同一菌株中??不同位点的拷贝数不同对菌株进行基因分型【６Ｓ】（如图１－４）。该基因分型是在真核生物中常用的方??法，具有操作简单、所需样本量少、分辨力髙、稳定性和重复性好、结果易于数字化等优点，便??于全球不同实验室进行结果比较［３７】，对于ＩＳ６１１０拷贝数很低的菌株也有很高的分型能力［６９］，是目??前最有前景的分型方法［７（Ｋ７２１。１９９７年，Ｓｕｐｐｌｙ等对ＢＣＧ和Ｍ?？ｗＺ）ｅｒｃｗ／ｏ＾ｓｅｎＸ３－ｒｅｇＸ３基因序列进??行比较分析，证实不同结核分枝杆菌的基因组中都存在多个相似的重复序列［７３］。通过对Ｈ３７ＲＶ进??行全基因组序列分析，发现了?４１个ＭＩＲＵ位点。通过设计特异性引物对４１个ＭＩＲＵ位点进行ＰＣＲ扩??增再进行测序分析，发现其中的１２个位点具有多态性，因此可作为ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ基因分型的依据??［叫。??采用ＭＩＲＵ－ＶＮＴＲ技术对结核分枝杆菌临床株进行基因分型的过程中
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