microRNA高效抑制的简易制备新方法以及miR-195/497对骨骼肌发育的调控

发布时间：2021-03-08 03:00

　　背景:miRNA参与调控了生命过程中各个方面,利用抑制剂对特定miRNA进行抑制研究中的常用手段。通过在体系中引入一段和miRNA序列碱基互补的核苷酸,miRNA抑制剂竞争性吸附miRNA,抑制其对靶基因作用。Tu D（Tough decoys）是目前被证明抑制效果最好的miRNA抑制剂,依赖于全基因合成的Tu D载体构建是阻碍Tu D应用的瓶颈。目的:载体构建过程中引入多重PCR、无缝连接等技术,构建成能同时表达Tu D元件的抑制载体dTuD（double Tough decoys）,提高构建效率和抑制效率。方法和结果:在优化抑制剂构建方面,首先我们将部分Tu D片断克隆到通用模板载体和受体载体上,通过两步PCR获得含MBS（miRNA binding sites）的Tu D片断后,经无缝连接插入到受体载体中,构建成dTuD载体。3’UTR荧光素酶报告实验证明dTuD能够抑制外源性miR-223。针对miR-195,-497,-322进行dTuD抑制,通过q RT-PCR和WB证明dTuD能够抑制内源性miRNA。在C2C12细胞中感染dTuD-miR-195和dTuD-miR-49... 

【文章来源】：深圳大学广东省

【文章页数】：92 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
缩略词表
microRNA高效抑制剂的简易制备新方法
    摘要
    Abstract
    第一章 前言
        1.1 micro RNA研究概述
        1.2 miRNA抑制剂
        1.3 不同miRNA抑制剂的比较
        1.4 本课题研究目的
    第二章 实验材料和方法
        2.1 材料和试剂
        2.2 仪器
        2.3 方法
    第三章 结果和分析
        3.1 dTuD载体构建流程
        3.2 dTuD抑制miRNA具有滴度效应
        3.3 dTuD抑制特异性
        3.4 dTuD抑制外源性miRNA
        3.5 dTuD抑制内源性miRNA
        3.6 dTuD应用于筛选与AP-1 信号通路相关的miRNA
        3.7 dTuD应用于小鼠抑制miR-1，使其下游基因Myogenin表达下调
    第四章 讨论
        4.1 dTuD载体构建方式的优化
        4.2 dTuD载体表达形式的优化
        4.3 抑制效果的评估方式
        4.4 Tu D载体的进一步优化
    第五章 结论
miR-195/497 对骨骼肌发育的调控
    摘要
    Abstract
    第一章 前言
        1.1 骨骼肌发育与成肌分化
        1.2 成肌分化的调控机制
        1.3 miRNA-195/497
        1.4 选题的目的和意义
    第二章 实验材料和方法
        2.1 材料和试剂
        2.2 方法
    第三章 结果和分析
        3.1 猪发育过程中miRNA表达谱绘制
        3.2 miR-195/497 在猪不同肌肉样本，小鼠发育过程中以及小鼠成肌细胞分化过程中的表达上调
        3.3 miR-195/497 抑制C2C12细胞增殖而促进成肌分化
        3.4 miR-195/497 直接靶向HMGA1的 3’UTR抑制其表达
        3.5 miR-195/497 抑制Id家族表达量
        3.6 miR-195/497 受到甲基化调控
    第四章 讨论
        4.1 miR-195/497 通过靶基因HMGA1调控成肌分化
        4.2 表达谱中的其他miRNA可能也参与了成肌分化
        4.3 miR-195/497-HMGA1-Id中更为复杂的调控机制
        4.4 miR-195/497 在肌肉发育和肌肉损伤修复中的应用展望
    第五章 结论
参考文献
附录
致谢
硕士期间发表论文



本文编号：3070294