嗜吞噬细胞无浆体和牛无浆体LAMP检测方法的建立与应用

发布时间：2021-03-09 00:21

　　无浆体病（Anaplasmosis）,旧称边虫病,是由各种无浆体（Anaplasma）经蜱传播而寄生于牛、羊、鹿等动物包括人的血细胞内,引起患病动物及人的一种慢性或急性传染性血液寄生虫病。该病主要引起动物的体重下降,产奶量下降,流产等,严重者可导致死亡,造成严重的经济损失。已知的无浆体病病原包括边缘无浆体（A. marginale）、中央无浆体（A.centrale）、嗜吞噬细胞无浆体（A. phagocytophilum）、绵羊无浆体（A.ovis）、牛无浆体（A. bovis）和扁平无浆体（A. platys）。建立高效、快速、准确的诊断方法,对该病的诊断及防控具有重要意义。本研究旨在建立特异性强、灵敏度高、操作简便且快速的环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）以检测嗜吞噬细胞无浆体和牛无浆体。利用实验室保存的嗜吞噬细胞无浆体阳性血液DNA样品建立LAMP方法。使用Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）,根据嗜吞噬细胞无... 

【文章来源】：河南农业大学河南省

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
致谢
摘要
文献综述
    引言
    1 病原学
        1.1 分类学
        1.2 形态学
    2 流行病学
        2.1 宿主
        2.2 传播途径
        2.3 分布与流行特点
    3 诊断方法
        3.1 病原学诊断
        3.2 血清学诊断
            3.2.1 补体结合试验（CFT）
            3.2.2 卡片凝集实验（CAT）
            3.2.3 间接免疫荧光抗体实验（IFA）
            3.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）
        3.3 分子生物学诊断
            3.3.1 常规PCR
            3.3.2 实时荧光定量PCR技术（FQ-PCR）
            3.3.3 环介导等温扩增法（LAMP）
            3.3.4 反向线状印迹技术（RLB）
    4 防治
        4.1 控制传染源,建立无无浆体疫区
        4.2 控制传播媒介蜱
            4.2.1 免疫防治
            4.2.2 遗传防治
            4.2.3 生物防治
        4.3 预防医源性传播
        4.4 药物治疗
        4.5 疫苗
第一部分 嗜吞噬细胞无浆体LAMP检测方法的建立与初步应用
    引言
    1 材料与方法
        1.1 虫种
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器及耗材
        1.4 主要溶液的配制
4溶液">            1.4.1 80mM MgSO₄溶液
            1.4.2 5M Betaine溶液
            1.4.3 LAMP 10×Buffer
            1.4.4 50×TAE缓冲液
            1.4.5 1.5%琼脂糖
        1.5 DNA的提取
        1.6 引物设计选择及合成
    2 LAMP法扩增体系的建立
        2.1 模板量的确定
        2.2 LAMP扩增体系的初步建立
        2.3 常规PCR方法
        2.4 巢式PCR方法
        2.5 LAMP反应的优化
            2.5.1 反应温度、时间的优化
            2.5.2 反应体系组成的优化
        2.6 敏感性试验
        2.7 特异性试验
        2.8 LAMP扩增产物的酶切鉴定
        2.9 LAMP扩增产物添加荧光染料检测
        2.10 临床样品检测试验
        2.11 不同LAMP方法的比较
    3 结果与分析
        3.1 反应温度、时间的优化结果
        3.2 反应体系优化结果
        3.3 特异性试验结果与分析
        3.4 敏感性试验结果与分析
        3.5 酶切后电泳结果与分析
        3.6 LAMP扩增产物添加染料及电泳检测
        3.7 临床样品检测结果
        3.8 不同LAMP方法的比较
    4 结论与讨论
        4.1 LAMP方法的评价
        4.2 LAMP扩增反应体系的优化
        4.3 LAMP敏感性和特异性
        4.4 LAMP产物检测
        4.5 临床样品的检测
        4.6 不同LAMP方法的比较
第二部分 牛无浆体LAMP检测方法的建立及初步应用
    引言
    1 材料与方法
        1.1 虫种
        1.2 主要试剂和仪器
        1.3 主要溶液的配制
        1.4 DNA的提取
        1.5 引物设计选择及合成
    2 LAMP法扩增体系的建立
        2.1 模板量的确定
        2.2 LAMP扩增体系的初步建立
        2.3 常规PCR方法
        2.4 巢式PCR方法
        2.5 LAMP反应的优化
            2.5.1 反应温度、时间的优化
            2.5.2 反应体系组成的优化
        2.6 敏感性试验
        2.7 特异性试验
        2.8 LAMP扩增产物添加荧光染料检测
        2.9 临床样品检测试验
    3 结果与分析
        3.1 反应温度、时间的优化结果
        3.2 反应体系优化结果
        3.3 特异性试验结果与分析
        3.4 敏感性试验结果与分析
        3.5 LAMP扩增产物添加染料及电泳检测
        3.6 临床样品测结果
    4 结论与讨论
        4.1 LAMP法检测牛无浆体方法的建立
        4.2 LAMP扩增反应体系的优化
        4.3 LAMP特异性和敏感性
        4.4 牛无浆体LAMP方法的检测效果
结论与创新点
参考文献
ABSTRACT
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]微小隐孢子虫LAMP检测方法的探索[J]. 史亚东,董海聚,王荣军,张龙现,宁长申,菅复春.  中国人兽共患病学报. 2012(12)
[2]西藏当雄县无浆体分子流行病学调查[J]. 孙彩琴,刘建枝,黄磊,罗布顿珠,汪月凤,刘志杰,罗建勋,殷宏.  动物医学进展. 2012(10)
[3]牛新孢子虫病LAMP检测方法的建立[J]. 金超,贾立军,曹世诺,栾杨,王娜,李月梅,张守发.  中国兽医科学. 2009(12)
[4]立克次体目微生物的系统分类进展[J]. 宝福凯,柳爱华.  中国人兽共患病学报. 2007(12)
[5]环媒恒温基因扩增法检测藤黄微球菌的研究[J]. 陈宇明,程天印,王晓君.  中国病原生物学杂志. 2006(06)
[6]蜱类防治研究进展[J]. 高志华,刘敬泽.  寄生虫与医学昆虫学报. 2003(04)
[7]我国牛羊边虫及边虫病的研究现状[J]. 党志胜,蒋锡仕,黄孝玢.  青海畜牧兽医杂志. 2003(04)
[8]间接荧光抗体诊断牛边缘边虫病的研究[J]. 余丰,吕文顺,张其才,吕文祥,窦惠芳,殷宏.  中国兽医科技. 1990(05)
[9]绵山羊边虫病的研究——实验羊边虫病的盐酸土霉素治疗[J]. 吕文祥,吕文顺,殷宏,张其才,窦惠芳,余丰.  中国兽医科技. 1989(12)

硕士论文
[1]绵羊无浆体和牛无浆体实时荧光定量PCR检测方法的建立[D]. 迟庆安.新疆农业大学 2013
[2]羊无浆体PCR诊断方法建立及分子流行病学调查[D]. 张菲菲.河南农业大学 2013
[3]1)边缘无浆体快速诊断试剂盒的研制 2)羊泰勒虫临床症状、血液学以及抗体变化的研究[D]. 袁建丰.华中农业大学 2005



本文编号：3071915