逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生

发布时间：2017-04-15 01:05

  本文关键词：逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禽白血病病毒(ALV)、禽网状组织增生症病毒(REV)与人的艾滋病病毒(HIV)同属于反转录病毒,由于反转录病毒极易突变的特性,迄今为止,由此类病毒引起的疾病均没有有效的疫苗,但是针对艾滋病,目前已经研发出很多药物能够对病毒产生抑制作用而使疾病得到一定的控制。本研究室在禽白血病病毒没有有效疫苗和目前使用的很多弱毒疫苗都存在REV污染并无有效方法去除的现状的基础上,根据病毒具有相似性的原理,利用对艾滋病有抑制作用的逆转录酶抑制剂类药物,试图探索此类药物在辅助禽白血病病毒净化中的可行性和在去除疫苗毒种中REV污染的可操作性。1、不同药物及其组合对ALV和REV的体外抑制作用及其应用首先通过在培养液中添加不同药物浓度连续传代以及利用CCK-8测定细胞活性的方法,确定了培养液中添加不超过5ug/ml的药物浓度对于DF-1细胞的复制没有影响。针对ALV的实验证实,当在培养液中添加不同的药物浓度时,药物浓度与抗病毒作用呈现正相关性,即药物浓度越高,对病毒复制的抑制作用越高;在针对REV的证实,当在培养液中分别添加5ug/ml的AZT或LAM以及两者联合应用时均可以显著抑制REV在DF-1细胞上的复制,通过在新城疫弱毒疫苗中人为添加REV模拟AZT或LAM以及两者联合应用对疫苗毒种中REV污染的净化作用,结果显示经药物干预4代后即将REV去除,并且净化后毒种检验合格。本研究证实了AZT或LAM在体外对REV的抑制作用,并在人工模拟实验中成功净化了疫苗毒种中污染的REV。2、在药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生经细胞活性实验和对病毒的抑制作用实验选定3ug/ml的AZT药物浓度作为药物选择压传代的最适浓度,在6孔细胞板中分别设置3个用药组和3个不添加药物组,在细胞上连传50代后,将6个毒株进行定量,再以相同的病毒量接种细胞,分别在0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml的浓度下进行培养,通过测定各组的p27判断出在3ug/ml药物浓度下,连传50代出现了耐药毒株。3、不同药物及其组合对ALV-J在海兰褐鸡体内复制的抑制作用通过给不同组别的鸡分别注射不同剂量的AZT后通过每周称重和检测对NDV和AIV-H9的抗体评估不同剂量AZT对鸡体重和免疫功能的影响,结果显示与对照组相比,体重和抗体水平差异均不显著。在人工攻毒ALV-J后,通过每周采集鸡抗凝血检测病毒血症阳性率,结果表明与不使用药物的对照组的持续病毒血症相比,10mg药物组的病毒血症在前6周没有出现,5mg药物组病毒血症在第7周时完全消失。综上所述,本研究不仅证实了AZT和LAM以及两种药物的联合用药对鸡反转录病毒的抑制作用,并且成功应用于降低ALV感染水平和去除疫苗中的REV污染,还构建了对AZT产生耐药性的ALV-J毒株,为进一步研究反转录病毒的耐药性产生的分子机制提供了良好的实验模型。
【关键词】：禽白血病病毒 逆转录酶抑制剂类药物 齐多夫定 拉米夫定 网状内皮组织增生症病毒
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 符号说明5-11
• 中文摘要11-13
• Abstract13-15
• 1 前言15-37
• 1.1 禽白血病病毒的研究进展15-23
• 1.1.1 禽白血病病毒的分类地位16
• 1.1.2 亚群分类16-17
• 1.1.3 J亚群禽白血病病毒的形态学与理化特征17-18
• 1.1.3.1 形态学特征17
• 1.1.3.2 理化特征17-18
• 1.1.4 J亚群禽白血病病毒的基因组结构及蛋白组成18-20
• 1.1.4.1 gag/pro基因及编码蛋白18-19
• 1.1.4.2 pol基因及编码蛋白19
• 1.1.4.3 env基因及编码蛋白19
• 1.1.4.4 UTR区19-20
• 1.1.4.5 LTR区20
• 1.1.5 J亚群禽白血病病毒的复制周期20-21
• 1.1.6 流行病学特点21-22
• 1.1.7 J亚群禽白血病病毒的致病性研究22
• 1.1.8 ALV-J的诊断22
• 1.1.9 ALV-J的预防22-23
• 1.2 禽网状内皮组织增生症（REV）的研究进展23-29
• 1.2.1 病原学23-25
• 1.2.1.1 病毒分类及毒株分类23
• 1.2.1.2 核酸及蛋白质组成23-24
• 1.2.1.3 病毒复制24-25
• 1.2.1.4 病毒稳定性25
• 1.2.2 流行病学25-27
• 1.2.2.1 水平传播途径25-26
• 1.2.2.2 垂直传播途径26
• 1.2.2.3 昆虫传播途径26
• 1.2.2.4 疫苗污染途径26-27
• 1.2.3 发病机理27
• 1.2.4 临床及病理变化27-28
• 1.2.4.1 病理变化27
• 1.2.4.2 生长抑制综合征27-28
• 1.2.5 诊断28
• 1.2.5.1 病毒分离及鉴定28
• 1.2.5.2 血清学检测28
• 1.2.6 预防和控制28-29
• 1.3 艾滋病研究进展29-36
• 1.3.1 病原学29-30
• 1.3.1.1 病毒分类及毒株分类29
• 1.3.1.2 病毒结构及核酸和蛋白质组成29-30
• 1.3.2 病毒的复制30-31
• 1.3.3 艾滋病的临床药物治疗31-33
• 1.3.3.1 药物作用靶点及作用原理31-32
• 1.3.3.2 临床治疗药物和治疗方案32-33
• 1.3.4 HIV逆转录酶及其抑制剂33-36
• 1.3.4.1 逆转录酶及临床应用33
• 1.3.4.2 核苷类逆转录酶抑制剂的作用机理33
• 1.3.4.3 临床应用的HIV-1 核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）33-34
• 1.3.4.4 齐多夫定（AZT）34-35
• 1.3.4.5 拉米夫定（LAM）35-36
• 1.4 本研究的目的和意义36-37
• 2 材料与方法37-46
• 2.1 试验材料37-38
• 2.1.1 毒株和细胞37
• 2.1.2 试验动物37
• 2.1.3 主要试剂和试剂盒37-38
• 2.1.4 实验主要使用的药物38
• 2.2 方法38-46
• 2.2.1 不同药物浓度的配制方法38
• 2.2.2 连续传代法确定DF-1 细胞复制无影响的药物浓度38
• 2.2.3 CCK-8 测定药物对DF-1 细胞活性的影响38-39
• 2.2.4 不同药物浓度对ALV-J在DF-1 细胞复制的抑制作用39-40
• 2.2.5 Reed-Muench法方法测定TCID5040
• 2.2.6 NX0101株在药物选择压下的连续传代40
• 2.2.7 NX0101株在药物选择压下的耐药性形成的验证40-41
• 2.2.8 不同药物浓度对海兰褐鸡生产性能的影响41
• 2.2.9 血凝血抑测定抗体滴度41-42
• 2.2.10 不同药物浓度对ALV-J在海兰褐鸡体内复制的抑制作用42
• 2.2.11 不同药物浓度对REV在DF-1 细胞上复制的抑制作用42-43
• 2.2.12 疫苗毒种中REV污染去除（洁净性）的检验43
• 2.2.13 药物干预后毒种接种SPF鸡的检验43
• 2.2.14 ELLISA测定血清中REV抗体43-44
• 2.2.15 间接免疫荧光实验：44-46
• 3 结果46-54
• 3.1 AZT对ALV-J在体内和体外的抑制作用46-50
• 3.1.1 不同AZT添加浓度对DF-1 细胞复制的影响46
• 3.1.2 不同AZT添加浓度对DF-1 细胞活性的影响46-47
• 3.1.3 不同AZT添加浓度对ALV-J在DF-1 细胞复制的抑制作用47-48
• 3.1.4 不同浓度AZT对海兰褐鸡生产性能的影响48-49
• 3.1.5 不同药物浓度对NDV和AIV-H9免疫后抗体反应的影响49-50
• 3.1.6 不同剂量AZT对ALV-J在海兰褐鸡内复制的抑制作用50
• 3.2 在药物选择压下ALV-J耐药毒株的形成50-52
• 3.2.1 第50代不同传代系耐药性形成的验证50-52
• 3.3 利用逆转录酶抑制剂类药物去除疫苗中的REV污染52-54
• 3.3.1 不同浓度AZT和LAM对REV在细胞复制的抑制作用52
• 3.3.2 AZT和LAM单独或联合应用去除疫苗毒种中REV污染52-53
• 3.3.3 IFA检测净化后疫苗毒种中REV53
• 3.3.4 SPF鸡接种法检测净化后疫苗毒种中REV污染53-54
• 4 讨论54-57
• 5 结论57-58
• 参考文献58-64
• 致谢64-65
• 硕士期间发表的论文65

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