JEV感染性克隆的构建及整合素αv/β3在JEV复制中功能研究

发布时间：2021-03-13 23:17

　　乙型脑炎（JE）是由乙型脑炎病毒（JEV）引起的一种以虫蚊为传播媒介的人畜共患传染病。JEV主要在猪—蚊—人这一循环中传播,其中猪是JEV重要的扩增贮存宿主,人是JEV的终末宿主。JEV感染的患者多数呈隐性感染,即使治愈后也会留有不可逆的脑部的炎症和严重的神经系统损伤,并且给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。目前JEV的生物信息学,免疫学方面及临床治疗等方面取得了一定的进展,同时疫苗的大量普及使得乙脑的发病率控制在一定范围之内,但是在JEV感染的分子机制方面还不是很清楚。目前24种整合素中的1/3识别不同病毒RGD序列,其中包括αββ3。现在已经证实它是口蹄疫病毒,腺病毒及某些黄病毒的功能性受体。JEV的囊膜蛋白E蛋白包括三个区域,其中结构域Ⅲ中的RGD序列,被推测认为是与受体结合的主要部位,能够介导病毒与宿主细胞的膜融合。本研究通过构建JEV感染性克隆,获得拯救的JEV病毒粒子,并对其进行一系列的生物学鉴定,多次传代证实病毒粒子能稳定遗传。同时开展整合素蛋白αv/β3对JEV复制的影响,探究其作为JEV功能性受体的可能性,为JEV入侵细胞机制的研究及今后抗JEV病毒新型药物研制提供理... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词（Abbreviation）
1 文献综述
    1.1 乙型脑炎的流行病学及历史
    1.2 JEV的病原学特性
        1.2.1 JEV理化特性
        1.2.2 JE的生物学特性
        1.2.3 JE的增殖特性
        1.2.4 JEV的致病机制
    1.3 JEV分子生物学特性
        1.3.1 JEV的基因组结构
        1.3.2 JEV的主要结构蛋白-E蛋白
    1.4 JEV感染的主要临床症状和病理变化
        1.4.1 JEV感染的临床症状及致病性
        1.4.2 JEV感染的病理变化
    1.5 JE的诊断及防治
    1.6 整合素的研究进展
        1.6.1 整合素的基因结构
        1.6.2 整合素的配体及分类
        1.6.3 整合素的活化机制-构象改变
        1.6.4 整合素的作用
        1.6.5 整合素αvβ3的简介
2 研究目的和意义
3 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 毒株、细胞与菌株
        3.1.2 载体与质粒
        3.1.3 工具酶和主要试剂
        3.1.4 主要培养基及其配制
        3.1.5 相关缓冲液与试剂及其配制
        3.1.6 本研究所使用的引物
    3.2 实验方法
        3.2.1 质粒构建
            3.2.1.1 感受态细胞制备（以大肠杆菌DH5α为例）
            3.2.1.2 限制性内切酶酶切反应
            3.2.1.3 PCR扩增反应
            3.2.1.4 PCR产物扩增,扩增产物及酶切产物的电泳检测
            3.2.1.5 PCR或酶切产物的回收纯化
            3.2.1.6 目的片段与载体连接反应
            3.2.1.7 连接产物的转化
            3.2.1.8 重组质粒的小量制备（OMEGA小提试剂盒）
            3.2.1.9 重组质粒的大量制备（OMEGA去内毒素大提试剂盒）
        3.2.2 定点突变技术改造质粒
        3.2.3 细胞的传代
        3.2.4 细胞转染
        3.2.5 空斑实验检测
            3.2.5.1 空斑前样品处理
            3.2.5.2 空斑实验方法
        3.2.6 间接免疫荧光检测
            3.2.6.1 间接免疫荧光试验前样品处理
            3.2.6.2 间接免疫荧光试验方法
        3.2.7 Western blotting检测
            3.2.7.1 检测样品的准备
            3.2.7.2 SDS-PAGE电泳
            3.2.7.3 Western blotting检测
        3.2.8 JEV增殖及毒价测定
            3.2.8.1 JEV增殖及病毒分离
            3.2.8.2 JEV毒价的测定
            3.2.8.3 病毒神经毒力,神经侵袭力的测定
        3.2.9 实时荧光定量PCR检测
            3.2.9.1 binding样品处理
            3.2.9.2 RNA的提取
            3.2.9.3 RNA纯度与浓度测定
            3.2.9.4 RNA的反转录过程
            3.2.9.5 Quantitative RT-PCR检测
        3.2.10 免疫共沉淀实验
4 结果与分析
    4.1 JEV感染性克隆的构建
        4.1.1 全长质粒的构建及病毒粒子的获得
        4.1.2 全长病毒粒子的鉴定
            4.1.2.1 RT-PCR鉴定
            4.1.2.2 Western blotting鉴定
            4.1.2.3 间接免疫荧光鉴定
            4.1.2.4 病毒空斑滴度及毒力的测定
            4.1.2.5 病毒一步法生长曲线的绘制
            4.1.2.6 两种病毒遗传稳定性的Western blotting检测
    4.2 整合素αv/β3在JEV复制中功能研究
        4.2.1 αv和β3对JEV复制的影响
            4.2.1.1 αv和β3下调表达对JEV复制影响
            4.2.1.2 宿主细胞αv和β3蛋白封闭后对JEV复制影响
            4.2.1.3 CHO细胞上过表达β3对JEV增殖的影响
                4.2.1.3.1 JEV在CHO细胞上的增殖
                4.2.1.3.2 CHO细胞过表达β3后JEV感染情况的鉴定
        4.2.2 αv/β3影响JEV复制的机制初步研究
            4.2.2.1 αv/β3影响JEV增殖过程中的吸附阶段
            4.2.2.2 RGD多肽对JEV复制的影响
            4.2.2.3 EDTA对JEV复制的影响
            4.2.2.4 αv/β3与JEV E蛋白相互作用
                4.2.2.4.1 真核表达质粒的构建
                4.2.2.4.2 蛋白共定位试验
                4.2.2.4.3 Co-IP检测蛋白相互作用
5 讨论分析
6 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪乙型脑炎的诊断与科学防治[J]. 赵以云,王强,左瑞华.  畜牧与饲料科学. 2009(Z1)
[2]流行性乙型脑炎的流行病学[J]. 彭颖,余光开.  医学综述. 2007(02)
[3]ανβ3抗体对人肝癌细胞系MHCC97的黏附抑制作用[J]. 王艳红,李立新,孙瑞霞,陈洁,刘银坤,叶胜龙.  中华实验外科杂志. 2006(05)
[4]流行性乙型脑炎的流行和防治现状──感染性疾病（3）[J]. 周伯平,陆坚.  新医学. 2004(10)

硕士论文
[1]猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定及E基因假病毒的构建[D]. 曹齐树.华中农业大学 2011
[2]乙型脑炎病毒四川株的分离鉴定及其生物学特性研究[D]. 郑文亚.四川农业大学 2010
[3]水稻类整合素蛋白的免疫定位及其编码基因的克隆与表达[D]. 张昌轮.扬州大学 2010
[4]流行性乙型脑炎病毒NS1蛋白单克隆抗体的制备及病毒特异性抗原表位鉴定[D]. 王斌.中国农业科学院 2009
[5]β3整合素作为汉坦病毒受体的鉴定以及其它候选受体的筛选[D]. 李青岭.重庆医科大学 2008



本文编号：3081078