鸡传染性喉气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立和亚单位疫苗研制

发布时间：2021-03-14 07:44

　　鸡传染性喉气管炎（ILT）是由传染性喉气管炎病毒（ILTV）引起的急性呼吸道疾病,给养鸡业造成巨大的经济损失。目前ILT的防控主要依赖疫苗接种,常用的疫苗是减毒活疫苗。但是减毒疫苗容易引起毒力返强,导致本病的发生和流行。因此,建立ILTV抗体的检测方法,以及研制保护力好、安全性高的新型疫苗,对于ILT的防控具有重要意义。本研究通过对ILTV Anhui-2011-2株gD基因所编码蛋白的信号肽和跨膜结构分析,用PCR扩增编码gD糖蛋白胞外区的基因片段（253nt～1218nt）,并克隆到供体质粒pFastBacHTA中。将其转化到感受态细胞DH10Bac/AcMNPV中进行转座,再经过筛选纯化得到穿梭质粒Bacmid-gD。用脂质体介导穿梭质粒转染Sf9细胞,得到重组杆状病毒AcMNPV-gD。用Western-blot可以检测到AcMNPV-gD的表达产物大小为50KD左右,并且与鸡抗ILTV多抗血清特异性结合。以高亲和Ni-NTA层析树脂纯化重组杆状病毒表达的gD蛋白,建立了检测ILTV抗体的间接ELISA方法。该方法与BioChek公司商品化试剂盒相比符合率为93.02%,与新城... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：43 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

ILTV基因组结构

图2-1 gD基因表达盒示意图Fig, 2-1 Illustration of gD gene expression cassette引物序列如下：gD/F:5'-GTTGAATTCGTCACGTACGACTACATTTTAGG-3'EcoR I酶切位点gD/R:5'-GTTGGTACCTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGAGACGGCATTAGAACTTKpn I酶切位点引物由南京金斯瑞生物技术有限公司合成。.1.2 ILTV gD基因的克隆与测序1)gD基因片段的克隆将毒株ILTV Anhui-2011-2接种到长至80%的单层LMH细胞，待细胞病变达到80

由于Bacmid中携带的mini-attTn7转座子两侧分别带有M13Forward (-40)和M13Reverse通用引物序列（图2-2)，可以用于重组穿梭质粒的鉴定，如果转座成功，则含有gD基因片段的PCR产物预期大小为3426 bp。PCR各参数设置如下：94°C预变性5min;94°C 变性 45s，55X：退火 45s, 72°C 延伸 4min，共 30 个循环；72°C 延伸 lOmin。PCR 产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。Transposed ^^^^^pFastBac?sequenceBacmid DNA 2430 bp M13(-40)F orward M13 Reverse图2-2重组Bacmid鉴定示意图Fig. 2-2 Illustration of identification for recombinant Bacmid


本文编号：3081763