猪脂肪沉积关键基因的筛选及锌指蛋白KLF13的功能研究
发布时间：2021-03-14 12:06
从生产角度,脂肪组织在不同部位的沉积对猪胴体性状和肉品质产生不同的影响,皮下脂肪沉积在皮下组织主要影响猪胴体性状,而肌内脂肪沉积在肌肉组织中主要影响猪肉品质。在组织发育特征上,皮下脂肪和肌内脂肪具有明显的时空特异性；进一步研究发现,在脂肪细胞生成过程中,来源于皮下和肌内的脂肪前体细胞呈现出不同的分化潜能。这些结果均暗示了在皮下和肌内脂肪前体脂肪成脂分化过程中可能存在不同的调控机制。因此,本研究的目的一方面通过比较猪皮下和肌内脂肪前体细胞在成脂分化过程中基因的表达水平,研究猪皮下和肌内脂肪前体细胞在分化过程中转录水平上的差异；另一方面通过筛选和分析猪皮下和肌内脂肪前体细胞成脂分化过程中的差异表达基因,鉴定出影响猪皮下和肌内脂肪分化的重要调控因子。本研究的内容分为三部分：第一部分主要是利用RNA-Seq技术比较皮下和肌内脂肪前体细胞在成脂分化过程中基因的表达水平；并研究皮下和肌内脂肪前体细胞之间的差异表达基因在成脂分化过程中表达变化规律。第二部分主要是在猪皮下和肌内脂肪前体细胞成脂分化过程中分别研究基因表达的变化情况,并通过后续的生物信息学分析来靶定影响猪脂肪分化的重要候选调控因子。第三部...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：142 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 文献综述
1 前言
2 猪脂肪组织沉积
2.1 猪脂肪组织沉积部位的分布
2.2 皮下脂肪与肌内脂肪的比较
3 脂肪细胞生成
3.1 动物体内脂肪细胞的来源
3.2 脂肪生成过程
3.3 调控脂肪分化的主要信号通路
3.4 调控脂肪分化的主要转录因子
3.4.1 转录因子在脂肪分化过程中的作用
3.4.2 脂肪分化的核心转录因子-PPARγ
3.4.3 脂肪分化的关键转录因子-C/EBPs家族
4 KLFs家族调控脂肪分化的研究进展
4.1 KLFs家族成员的结构和功能
4.2 KLFs在脂肪分化过程中的作用及方式
4.2.1 促进脂肪分化的KLFs
4.2.2 抑制脂肪分化的KLFs
4.3 KLF13研究进展
4.3.1 KLF13结构及特点
4.3.2 KLF13的功能研究
5 从转录水平筛选和鉴定猪脂肪分化过程中重要转录因子
5.1 高通量筛选差异表达基因的技术
5.1.1 表达谱芯片
5.1.2 RNA-Seq技术
5.2 从差异表达基因到转录因子
5.3 生物信息学分析和靶定与猪脂肪分化相关的转录因子
5.4 鉴定猪脂肪分化过程中新转录因子的研究策略
6 课题研究的目的意义
第二章 猪皮下和肌内脂肪前体细胞成脂分化过程中基因表达水平的比较与分析
1 前言
2 材料与方法
2.1 分离猪皮下脂肪和肌肉中SV细胞
2.2 皮下脂肪和肌肉内SV细胞的成脂诱导以及样品收集
2.3 总RNA抽提
2.4 cDNA文库的构建和HiSeq 2000平台的测序
2.5 差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）的筛选
2.6 Q-PCR分析
2.7 基因的功能注释
2.8 基因表达模式的聚类分析
3 结果与分析
3.1 Illumina HiSeq2000高通量测序结果的数据统计分析
3.2 注释基因的分析
3.3 在成脂分化过程中比较ASVC和MSVC的基因表达
3.4 Q-PCR验证DEGs的表达
3.5 ASVC和MSVC之间DEGs的功能注释
3.6 ASVC和MSVC之间DEGs在成脂分化中表达模式的聚类分析
4 讨论
4.1 比较ASVC和MSVC在成脂分化过程中基因表达水平的差异
4.2 ASVC和MSVC之间DEGs的功能注释
第三章 猪皮下和肌内脂肪前体细胞成脂分化过程中差异表达基因的筛选与分析
1 前言
2 材料与方法
2.1 分离猪皮下脂肪和肌肉中SV细胞
2.2 皮下脂肪和肌肉内SV细胞的成脂诱导以及样品收集
2.3 总RNA抽提
2.4 差异表达基因的筛选
2.5 基因表达模式的聚类分析
2.6 基因的功能注释
2.7 转录因子结合位点的分析
3 结果与分析
3.1 ASVC和MSVC成脂分化过程中DEGs的筛选
3.2 ASVC和MSVC成脂分化过程中DEGs表达模式的聚类分析
3.3 显著性表达模式中DEGs的功能注释
3.5 ASVC和MSVC成脂分化过程中候选转录因子基因的筛选
4 讨论
4.1 ASVC和MSVC成脂分化过程中的DEGs
4.2 ASVC和MSVC成脂分化过程中DEGs的表达模式聚类分析
4.3 显著性表达模式中DEGs的功能注释
4.4 ASVC和MSVC成脂分化过程中的候选转录因子
第四章 KLF13特异性调控猪脂肪分化的机制
1 前言
2 材料和方法
2.1 试验材料
2.1.1 动物、细胞和细菌材料
2.1.2 载体和质粒
2.2 主要仪器、试剂和溶液的配制
2.2.1 主要仪器
2.2.2 主要试剂和试剂盒
2.2.3 主要溶液的配制
2.3 试验方法
2.3.1 猪脂肪和肌肉SV细胞的分离同第二章2.1
2.3.2 猪成熟脂肪细胞的分离和DFAT细胞的获得
2.3.3 成脂诱导的方式
2.3.4 油红O染色
2.3.5 总RNA抽提及反转录
2.3.6 基因组DNA的抽提
2.3.7 基因的克隆和表达质粒的构建
2.3.8 Real-time PCR
2.3.9 Western Blot
2.3.10 启动子的突变和删除
2.3.11 细胞转染
2.3.12 双荧光素酶活性检测
2.3.13 染色质免疫沉淀
2.3.14 统计分析
3 结果与分析
3.1 KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响
3.1.1 KLF13在猪脂肪SV细胞成脂分化过程中的表达模式
3.1.2 siRNA干涉KLF13的表达对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响
3.1.3 超表达KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响
3.2 KLF13对猪肌肉SV细胞成脂分化的影响
3.2.1 KLF13在猪肌肉SV细胞成脂分化过程中的表达模式
3.2.2 干涉KLF13对猪肌肉SV细胞成脂分化的影响
3.3 KLF13对猪DFAT细胞成脂分化的影响
3.3.1 KLF13在猪DFAT细胞成脂分化过程中的表达模式
3.3.2 干涉KLF13对猪DFAT细胞成脂分化的影响
3.4 KLF13调控猪脂肪分化所介导的靶基因的筛选
3.4.1 干涉KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.2 超表达KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.3 在成脂诱导条件下干涉KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.4 在成脂诱导条件下超表达KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.5 在成脂诱导条件下干涉KLF13对猪DFAT细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.6 候选靶基因启动子上KLF13结合位点的预测
3.4.7 在成脂诱导条件下干涉和超表达KLF13对猪脂肪SV细胞PPARγ蛋白水平的影响
3.5 KLF13调控猪脂肪分化的机制
3.5.1 KLF13对截短的猪源PPARγ启动子活性的影响
3.5.2 KLF13对突变和删除KLF13结合位点的PPARγ启动子活性的影响
3.5.3 ChIP试验验证KLF13与猪源PPARγ启动子的结合
3.6 KLF13对鼠脂肪分化的影响
3.6.1 KLF13对鼠源前脂肪细胞系3T3-L1成脂分化过程中的表达模式
3.6.2 干涉KLF13对鼠源前脂肪细胞系3T3-L1成脂分化的影响
3.6.3 在成脂诱导条件下干涉KLF13对鼠成脂分化关键基因表达的影响
3.6.4 在成脂诱导条件下超表达KLF13对鼠成脂分化关键基因表达的影响
3.6.5 KLF13对鼠源PPARγ2启动子活性的影响
4 讨论
4.1 KLF13可以影响猪脂肪前体细胞成脂分化
4.2 KLF13通过PPARγ介导来影响猪脂肪分化
4.3 KLF13调控猪和鼠脂肪分化存在种属特异性
第五章 结语
1 研究结论
2 创新点
3 本研究不足之处
参考文献
研究生在读期间发表论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]A familiar stranger:CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue[J]. Arnaud Scherberich,Nunzia Di Maggio,Kelly M McNagny. World Journal of Stem Cells. 2013(01)
[2]基因芯片与高通量DNA测序技术前景分析[J]. 滕晓坤,肖华胜. 中国科学（C辑:生命科学）. 2008(10)
本文编号：3082148
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：142 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 文献综述
1 前言
2 猪脂肪组织沉积
2.1 猪脂肪组织沉积部位的分布
2.2 皮下脂肪与肌内脂肪的比较
3 脂肪细胞生成
3.1 动物体内脂肪细胞的来源
3.2 脂肪生成过程
3.3 调控脂肪分化的主要信号通路
3.4 调控脂肪分化的主要转录因子
3.4.1 转录因子在脂肪分化过程中的作用
3.4.2 脂肪分化的核心转录因子-PPARγ
3.4.3 脂肪分化的关键转录因子-C/EBPs家族
4 KLFs家族调控脂肪分化的研究进展
4.1 KLFs家族成员的结构和功能
4.2 KLFs在脂肪分化过程中的作用及方式
4.2.1 促进脂肪分化的KLFs
4.2.2 抑制脂肪分化的KLFs
4.3 KLF13研究进展
4.3.1 KLF13结构及特点
4.3.2 KLF13的功能研究
5 从转录水平筛选和鉴定猪脂肪分化过程中重要转录因子
5.1 高通量筛选差异表达基因的技术
5.1.1 表达谱芯片
5.1.2 RNA-Seq技术
5.2 从差异表达基因到转录因子
5.3 生物信息学分析和靶定与猪脂肪分化相关的转录因子
5.4 鉴定猪脂肪分化过程中新转录因子的研究策略
6 课题研究的目的意义
第二章 猪皮下和肌内脂肪前体细胞成脂分化过程中基因表达水平的比较与分析
1 前言
2 材料与方法
2.1 分离猪皮下脂肪和肌肉中SV细胞
2.2 皮下脂肪和肌肉内SV细胞的成脂诱导以及样品收集
2.3 总RNA抽提
2.4 cDNA文库的构建和HiSeq 2000平台的测序
2.5 差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）的筛选
2.6 Q-PCR分析
2.7 基因的功能注释
2.8 基因表达模式的聚类分析
3 结果与分析
3.1 Illumina HiSeq2000高通量测序结果的数据统计分析
3.2 注释基因的分析
3.3 在成脂分化过程中比较ASVC和MSVC的基因表达
3.4 Q-PCR验证DEGs的表达
3.5 ASVC和MSVC之间DEGs的功能注释
3.6 ASVC和MSVC之间DEGs在成脂分化中表达模式的聚类分析
4 讨论
4.1 比较ASVC和MSVC在成脂分化过程中基因表达水平的差异
4.2 ASVC和MSVC之间DEGs的功能注释
第三章 猪皮下和肌内脂肪前体细胞成脂分化过程中差异表达基因的筛选与分析
1 前言
2 材料与方法
2.1 分离猪皮下脂肪和肌肉中SV细胞
2.2 皮下脂肪和肌肉内SV细胞的成脂诱导以及样品收集
2.3 总RNA抽提
2.4 差异表达基因的筛选
2.5 基因表达模式的聚类分析
2.6 基因的功能注释
2.7 转录因子结合位点的分析
3 结果与分析
3.1 ASVC和MSVC成脂分化过程中DEGs的筛选
3.2 ASVC和MSVC成脂分化过程中DEGs表达模式的聚类分析
3.3 显著性表达模式中DEGs的功能注释
3.5 ASVC和MSVC成脂分化过程中候选转录因子基因的筛选
4 讨论
4.1 ASVC和MSVC成脂分化过程中的DEGs
4.2 ASVC和MSVC成脂分化过程中DEGs的表达模式聚类分析
4.3 显著性表达模式中DEGs的功能注释
4.4 ASVC和MSVC成脂分化过程中的候选转录因子
第四章 KLF13特异性调控猪脂肪分化的机制
1 前言
2 材料和方法
2.1 试验材料
2.1.1 动物、细胞和细菌材料
2.1.2 载体和质粒
2.2 主要仪器、试剂和溶液的配制
2.2.1 主要仪器
2.2.2 主要试剂和试剂盒
2.2.3 主要溶液的配制
2.3 试验方法
2.3.1 猪脂肪和肌肉SV细胞的分离同第二章2.1
2.3.2 猪成熟脂肪细胞的分离和DFAT细胞的获得
2.3.3 成脂诱导的方式
2.3.4 油红O染色
2.3.5 总RNA抽提及反转录
2.3.6 基因组DNA的抽提
2.3.7 基因的克隆和表达质粒的构建
2.3.8 Real-time PCR
2.3.9 Western Blot
2.3.10 启动子的突变和删除
2.3.11 细胞转染
2.3.12 双荧光素酶活性检测
2.3.13 染色质免疫沉淀
2.3.14 统计分析
3 结果与分析
3.1 KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响
3.1.1 KLF13在猪脂肪SV细胞成脂分化过程中的表达模式
3.1.2 siRNA干涉KLF13的表达对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响
3.1.3 超表达KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化的影响
3.2 KLF13对猪肌肉SV细胞成脂分化的影响
3.2.1 KLF13在猪肌肉SV细胞成脂分化过程中的表达模式
3.2.2 干涉KLF13对猪肌肉SV细胞成脂分化的影响
3.3 KLF13对猪DFAT细胞成脂分化的影响
3.3.1 KLF13在猪DFAT细胞成脂分化过程中的表达模式
3.3.2 干涉KLF13对猪DFAT细胞成脂分化的影响
3.4 KLF13调控猪脂肪分化所介导的靶基因的筛选
3.4.1 干涉KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.2 超表达KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.3 在成脂诱导条件下干涉KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.4 在成脂诱导条件下超表达KLF13对猪脂肪SV细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.5 在成脂诱导条件下干涉KLF13对猪DFAT细胞成脂分化关键基因表达的影响
3.4.6 候选靶基因启动子上KLF13结合位点的预测
3.4.7 在成脂诱导条件下干涉和超表达KLF13对猪脂肪SV细胞PPARγ蛋白水平的影响
3.5 KLF13调控猪脂肪分化的机制
3.5.1 KLF13对截短的猪源PPARγ启动子活性的影响
3.5.2 KLF13对突变和删除KLF13结合位点的PPARγ启动子活性的影响
3.5.3 ChIP试验验证KLF13与猪源PPARγ启动子的结合
3.6 KLF13对鼠脂肪分化的影响
3.6.1 KLF13对鼠源前脂肪细胞系3T3-L1成脂分化过程中的表达模式
3.6.2 干涉KLF13对鼠源前脂肪细胞系3T3-L1成脂分化的影响
3.6.3 在成脂诱导条件下干涉KLF13对鼠成脂分化关键基因表达的影响
3.6.4 在成脂诱导条件下超表达KLF13对鼠成脂分化关键基因表达的影响
3.6.5 KLF13对鼠源PPARγ2启动子活性的影响
4 讨论
4.1 KLF13可以影响猪脂肪前体细胞成脂分化
4.2 KLF13通过PPARγ介导来影响猪脂肪分化
4.3 KLF13调控猪和鼠脂肪分化存在种属特异性
第五章 结语
1 研究结论
2 创新点
3 本研究不足之处
参考文献
研究生在读期间发表论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]A familiar stranger:CD34 expression and putative functions in SVF cells of adipose tissue[J]. Arnaud Scherberich,Nunzia Di Maggio,Kelly M McNagny. World Journal of Stem Cells. 2013(01)
[2]基因芯片与高通量DNA测序技术前景分析[J]. 滕晓坤,肖华胜. 中国科学（C辑:生命科学）. 2008(10)
本文编号：3082148
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