猪轮状病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立及初步应用

发布时间：2021-03-14 22:03

　　猪轮状病毒感染（Porcine rotavirus, PoRV）是一种严重的接触性肠道传染病,导致仔猪出现呕吐、腹泻、脱水和消瘦等临床症状,也能够致使仔猪死亡,特别是对7日龄左右的仔猪造成的危害最为严重。该病主要暴发于寒冷时期的冬季以及早春时节,且传播迅速,给养猪产业带来巨大的损失。现阶段实验室对PoRV病原的检测主要是利用常规RT-PCR方法,但是常规RT-PCR方法相对于荧光定量RT-PCR灵敏度较低。常规RT-PCR只能检测到发病严重时期的猪只,对轮状病毒感染早期的猪只,则需要灵敏度更高的检测方法来实现,以达到在猪感染的潜伏期就可以诊断并采取有效的防控措施来减少PoRV的暴发带来的损失。本试验主要是为临床检测PoRV建立灵敏性更高的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。根据GenBank中登录的A群猪轮状病毒（PoRV）TM-a毒株序列,我们针对结构蛋白VP6基因设计了一对常规RT-PCR特异性引物和一对荧光定量RT-PCR特异性引物和探针,将通过常规RT-PCR扩增VP6获得的目的片段与pMD-18T载体连接构建标准阳性质粒,建立了检测A群PoRV的TaqMan荧光定量RT-P... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
1 文献综述
    1.1 轮状病毒的历史
    1.2 轮状病毒的形态、结构和基因组
    1.3 轮状病毒的理化特性和培养特性
    1.4 轮状病毒的流行病学
    1.5 轮状病毒感染的临床症状和病理变化
    1.6 轮状病毒的诊断方法研究进展
    1.7 轮状病毒感染的免疫机制
        1.7.1 局部黏膜免疫保护机制
        1.7.2 体液免疫
        1.7.3 细胞免疫
        1.7.4 其他非免疫机制
    1.8 荧光定量RT-PCR原理与应用
        1.8.1 定量原理
        1.8.2 FQ-PCR反应方法的分类
            1.8.2.1 非特异性DNA结合染料法
            1.8.2.2 TaqMan探针
            1.8.2.3 分子信标
            1.8.2.4 杂交探针
            1.8.2.5 复合探针
        1.8.3 实时荧光定量PCR的应用
2 研究的目的与意义
3 材料与方法
    3.1 材料
        3.1.1 病毒、细胞及临床病料
        3.1.2 试验动物
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 主要试剂和药品
        3.1.5 主要培养基的配置
    3.2 试验方法
        3.2.1 引物与探针的设计
        3.2.2 病毒核酸的提取
            3.2.2.1 DNA病毒Total DNA的提取
            3.2.2.2 RNA病毒Total RNA的提取
            3.2.2.3 cDNA的制备
        3.2.3 阳性标准质粒的制备
            3.2.3.1 引物的设计
            3.2.3.2 目的片段的扩增
            3.2.3.3 扩增产物的回收与纯化
            3.2.3.4 纯化产物与载体的连接
            3.2.3.5 感受态制备
            3.2.3.6 转化
            3.2.3.7 质粒的大量提取
            3.2.3.8 质粒的鉴定
        3.2.4 实时定量RT-PCR反应体系的建立
        3.2.5 标准曲线的制备
        3.2.6 特异性试验
        3.2.7 敏感性试验
        3.2.8 重复性试验
        3.2.9 临床病例的检测
        3.2.10 PoRV细胞培养物的检测
        3.2.11 人工动物试验
        3.2.12 实时荧光定量RT-PCR
            3.2.12.1 试验动物组织中病毒RNA的提取
            3.2.12.2 荧光定量RT-PCR检测
        3.2.13 组织切片制备
        3.2.14 HE染色
        3.2.15 免疫组化法检测试验猪的病毒含量情况
4 结果与分析
    4.1 标准质粒的制备
    4.2 荧光定量RT-PCR反应体系的建立及标准曲线的制备
    4.3 特异性试验
    4.4 敏感性试验
    4.5 重复性试验
    4.6 临床病例的检测
    4.7 PoRV细胞培养物中病毒载量的检测
    4.8 人工动物试验
    4.9 荧光定量RT-PCR检测人工感染猪粪便排毒量
    4.10 病理学检测
        4.10.1 HE染色检测
        4.10.2 免疫组化法对病毒的检测
5 讨论
    5.1 荧光定量PCR技术讨论
    5.2 猪轮状病毒致病特性
    5.3 猪轮状病毒的排毒规律探讨
    5.4 试验中需要注意的问题
6 结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3083031