五指山小型猪SLA单倍型分型及异种移植配型研究

发布时间：2017-04-15 19:15

  本文关键词：五指山小型猪SLA单倍型分型及异种移植配型研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：猪主要组织相容性复合体又被称为猪白细胞抗原(Swine Lymphocyte Antig en,SLA),由高度多态且紧密连锁遗传的基因簇组成,在抗原递呈、免疫调节及疾病的抵抗等方面起重要的作用。研究表明,异种移植时SLA可作为移植抗原引起免疫排斥反应,以不同SLA单倍型猪为供体进行异种器官移植后,移植效果存在明显差异。五指山小型猪是目前我国异种器官移植研究常用实验动物之一,为明晰五指山小型猪SLA I类和II类基因的等位基因及单倍型分布情况,本研究利用分子克隆测序并结合PCR-SSP方法对35头五指山小型猪SLA单倍型分型,同时在体外进行补体依赖的淋巴细胞毒试验(Complement dependent cytotoxicity,C DC),分析不同单倍型个体与异种移植免疫排斥的关联性,以期为异种器官移植研究提供一些基础数据。获得的主要研究结果如下:1.五指山小型猪封闭群体中,SLA-1基因座的2条均为新发现的等位基因序列,将序列提交于GenBank和ISAG(International Society Animal Genetics),并获取相应的序列号及等位基因名称:SLA-1*0401wz01(GenBank登录号:KT715501),SLA-1*0703(GenBank登录号:KT194212);SLA-2基因座的SLA-2*1102为已发现的等位基因,SLA-2*11wz01(GenBank登录号:KT194213)为新发现的等位基因;SLA-3、SLA-DRB1和SLA-DQB1基因座的等位基因序列均已被报道,分别为SLA-3*0401、SLA-3*0403、SLA-DRB1*0901、SLA-DRB1*0401、SLA-DQB1*0901和SLA-DQB1*0501。2.本研究群体中新发现了3个SLAⅠ类和2个SLAⅡ类单倍型,被ISAG命名委员会依次命名为:Hp-75.00(SLA-1*0401wz01,SLA-3*0403,SLA-2*11wz01);H p-76b.00(SLA-1*0703,SLA-3*0401,SLA-2*11wz01);Hp-76a.00(SLA-1*0703,SLA-3*0401,SLA-2*1102);Hp-00.27(SLA-DRB1*0901,SLA-DQB1*0901);Hp-00.41(SLA-DRB1*0401,SLA-DQB1*0501)。3.根据五指山小型猪基础群中获得SLA基因等位基因的序列特征,共设计10对序列特异性引物并验证其有效,利用PCR-SSP方法在DNA水平上对子代个体进行SLA分型,最终发现子代个体中存在基础群体中的4种单倍型。4.将五指山小型猪获得的10条SLA等位基因氨基酸序列分别与人CD4、CD8分子识别的HLA分子氨基酸序列及与HLAⅠ类基因KIR结合区重要氨基酸同源性比较发现,五指山小型猪SLA分子与人HLA同源性较高,并且SLA-DRB1基因座上的等位基因序列与人CD4分子识别的HLA分子关键结合域氨基酸序列完全相同。5.本研究群体五指山小型猪血型为A型。杂合单倍型(Hp-75a.27/76a.41)个体和纯合单倍型(Hp-76a.41/76a.41、Hp-75.27/75.27)个体PBMC分别与灭火的猴、人血清反应。结果发现,人血清与不同单倍型PBMC反应后,细胞死亡率差异显著(P0.05),AB、BB型细胞死亡率明显高于AA型。然而,猴血清与不同单倍型PBMC反应后差异不显著。本研究首次系统地完成了五指山小型猪SLA经典Ⅰ类以及SLAⅡ类单倍型分型,并获得Hp-76a.41、Hp-75.27两种纯合单倍型家系。体外初步研究发现异种移植免疫排斥的强弱与猪SLA单倍型的类型相关性较低,但经人源化修饰的五指山小型猪PBMC与人或猴血清反应后,细胞死亡率相对较低。因此,五指山小型猪可作为未来猪-人异种器官移植的良好供体之一。
【关键词】：五指山小型猪 SLA 单倍型 异种移植 免疫排斥 血型
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 摘要4-6
• Summary6-11
• 第一章 文献综述11-25
• 1 异种器官移植免疫排斥概况11-13
• 2 SLA基因研究13-23
• 2.1 SLA简介13
• 2.2 SLAⅠ类基因13-15
• 2.3 SLAⅡ类基因15-16
• 2.4 SLA III类基因16
• 2.5 SLA遗传特征16-17
• 2.6 SLA生物学功能17-18
• 2.7 SLA分型方法及研究进展18-21
• 2.7.1 血清学分型18-19
• 2.7.2 细胞学分型19
• 2.7.3 分子生物学分型19-21
• 2.8 SLA等位基因及单倍型命名21-22
• 2.8.1 SLA等位基因命名21-22
• 2.8.2 SLA单倍型命名22
• 2.9 SLA单倍型与器官移植的关系22-23
• 3 异种器官移植配型研究23-24
• 3.1 血型配型23
• 3.2 MHC配型23-24
• 4 本研究的目的及意义24-25
• 第二章 五指山小型猪SLA单倍型分型25-48
• 1 材料与方法25-35
• 1.1 材料25
• 1.2 主要仪器设备25
• 1.3 主要试剂及配制25-26
• 1.4 试验方法26-35
• 1.4.1试验设计26-27
• 1.4.2 组织RNA的提取和检测27-28
• 1.4.3 反转录RNA28-29
• 1.4.4 SLA基因的扩增29-30
• 1.4.5 PCR扩增产物回收30-31
• 1.4.6 连接与转化31-32
• 1.4.7 单菌落阳性鉴定及测序32
• 1.4.8 序列分析32-33
• 1.4.9 PCR-SSP分型方法的建立33-35
• 2 结果与分析35-45
• 2.1 RNA质量检测结果35-36
• 2.2 目的基因的扩增结果36-37
• 2.3 菌液阳性鉴定结果37
• 2.4 DNA双向测序结果37-38
• 2.5 五指山小型猪SLA等位基因及新发现的等位基因的命名结果38-39
• 2.6 同源性分析结果39-41
• 2.7 子代PCR-SSP检测结果41-43
• 2.8 五指山小型猪检测群体中等位基因的分布结果43-45
• 2.9 五指山小型猪检测群体中单倍型分布结果45
• 3 讨论45-47
• 3.1关于SLAⅠ类与Ⅱ类分子功能基因氨基酸序列与HLA同源性分析45-47
• 3.2 五指山小型猪检测群体中单倍型分布47
• 4 小结47-48
• 第三章 异种移植配型研究48-55
• 1 材料与方法48-51
• 1.1 材料48
• 1.2 主要仪器设备48
• 1.3 主要试剂及配制48-49
• 1.4 试验方法49-51
• 1.4.1 试验设计49
• 1.4.2 GGTA1-/-五指山小型猪AO血型的检测49
• 1.4.3 GGTA1-/-五指山小型猪外周血单核细胞的分离49-50
• 1.4.4 GGTA1基因表达检测50
• 1.4.5 淋巴细胞毒配型实验（CDC）50-51
• 2 结果51-53
• 2.1 GGTA1基因表达检测结果51
• 2.2 CDC流式检测结果51-52
• 2.3 统计分析结果52-53
• 3 讨论53
• 4 小结53-55
• 第四章 全文总结55-56
• 致谢56-57
• 参考文献57-65
• 作者简介65-66
• 导师简介66-67

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