扬州鹅α-干扰素的克隆表达及其生物学活性研究
发布时间：2021-03-24 11:19
干扰素是一类重要的细胞因子,具有广谱的抗病毒活性,良好的抑制细胞分裂、抗肿瘤活性以及高效的免疫调节等功能。近来,禽类相关的干扰素研究正不断地深入,尤其是就鸡和鸭干扰素而言,但鹅干扰素的相关研究报道还尚少。本实验选择抗病毒活性较强的Ⅰ型α干扰素,参考GenBank上发表的鹅IFN-a基因序列（HQ115583）设计引物,以地方品种扬州鹅（Yangzhou goose）为实验动物。采用RT-PCR的方法成功扩增出扬州鹅IFN-a全基因与成熟基因片段,大小分别为576bp、486bp。将IFN-a全长基因克隆至pGEM-T载体中,将重组质粒pGEM-T-GoIFN-a送至测序,结果表明扩增出的扬州鹅IFN-a全长基因与HQ115583在核苷酸水平上同源性达99.6%。将IFN-a成熟基因克隆至pET32a（+）载体中,构建了原核表达载体pET32a-mGoIFN-α。转化至大肠杆菌DH5a（DE3）后经IPTG诱导表达得到大小为36.3kDa的重组融合蛋白。对上述包涵体蛋白进行纯化,基本上能够得到单一的特异性条带,并通过Western Blotting检测纯化后蛋白,结果与预期一致。用重组蛋...
【文章来源】：南京师范大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：102 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
图表清单
缩略词表
第一章 干扰素的研究概况
1 干扰素的分类及特征
2 干扰素的分子结构及特点
3 干扰素的产生与作用特性
3.1 干扰素受体
3.2 干扰素的信号转导与基因调控
3.3 干扰素诱生剂
4 干扰素的生物学功能
4.1 抗病毒活性
4.2 抗肿瘤活性
4.3 抗寄生虫活性
4.4 免疫调节活性
4.5 免疫佐剂活性
第二章 禽类干扰素的研究进展
第三章 研究的目的和意义
第四章 扬州鹅IFN-α基因的克隆与生物信息学分析
1 材料
1.1 实验动物
1.2 表达载体与菌株
1.3 仪器设备
1.4 主要试剂及其配制
1.4.1 培养基
1.4.2 总RNA的提取与细胞培养所需试剂
1.4.3 粗提质粒试剂
1.4.4 核酸电泳试剂
1.4.5 感受态细胞制备试剂
2 方法
2.1 扬州鹅IFN-α基因的RT-PCR扩增
2.1.1 引物设计与合成
2.1.2 提取扬州鹅外周血总RNA
2.1.2.1 提取经刀豆素（ConA）诱导培养的鹅外周血淋巴细胞的总RNA
2.1.2.2 提取未经诱导培养的鹅外周血淋巴细胞的总RNA
2.1.2.3 提取鹅外周血淋巴细胞中总RNA
2.1.2.4 提取鹅外周全血中的总RNA
2.1.3 RT-PCR扩增扬州鹅IFN-α全长基因
2.1.3.1 GoIFN-α基因的反转录（RT）
2.1.3.2 GoIFN-α全长基因的PCR扩增
2.1.4 扩增产物的纯化
2.2 扬州鹅IFN-α基因的T-载体克隆与鉴定
2.2.1 IFN-α基因与pGEM-T easy的连接
2.2.2 感受态细胞的制备及连接产物的转化
2.2.2.1 DH5a感受态细饱的制备
2.2.2.2 连接产物转化感受态细胞
2.2.3 转化菌落的筛选与鉴定
2.2.3.1 阳性重组质粒的筛选
2.2.3.2 重组质粒pGEM-T-GoIFN-α的鉴定
3 结果
3.1 扬州鹅IFN-α全基因的扩增
3.2 克隆质粒pGEM-T-GoIFN-α的鉴定
3.3 扬州鹅IFN-α基因的生物信息学分析
3.3.1 扬州鹅IFN-α核苷酸序列测序结果
3.3.2 扬州鹅IFN-α氨基酸序列测序结果
3.3.3 扬州鹅IFN-α同源性分析
3.3.4 扬州鹅IFN-α进化树分析
4 讨论
4.1 RNA提取方法的分析
4.2 扬州鹅IFN-α同源性等生物信息学分析
第五章 扬州鹅IFN-α基因的原核表达与高免血清的制备
1 材料
1.1 实验动物
1.2 表达载体与菌株
1.3 仪器设备
1.4 主要试剂及其配制
1.4.1 培养基
1.4.2 粗提质粒试剂
1.4.3 核酸电泳试剂
1.4.4 感受态细胞制备试剂
1.4.5 原核表达所需试剂
1.4.6 蛋白质电泳和Western Blotting所需试剂
1.4.7 ELISA试剂
2 方法
2.1 扬州鹅IFN-α成熟肽基因的RT-PCR
2.1.1 引物设计与合成
2.1.2 RT-PCR扩增扬州鹅IFN-α成熟肽基因
2.1.2. 1 GoIFN-α基因的反转录（RT）
2.1.2.2 GoIFN-α成熟肽基因的PCR扩增
2.1.3 扩增产物的纯化
2.2 载体pET32a（+）质粒提取、酶切与回收纯化
2.3 扬州鹅IFN-α成熟肽基因的原核表达载体的构建
2.3.1 目的片段与pET32a（+）载体的连接
2.3.2 感受态细胞的制备与连接产物的转化
2.3.3 重组质粒的筛选与鉴定
2.3.3.1 阳性重组质粒的筛选
2.3.3.2 重组质粒pET32a-mGoIFN-α的鉴定
2.4 重组蛋白的诱导表达
2.4.1 重组质粒pET32a-mGoIFN-α转化表达菌
2.4.2 工程菌的诱导表达
2.4.3 SDS-PAGE电泳
2.4.4 表达条件的优化
2.4.4.1 诱导时间的摸索
2.4.4.2 IPTG最佳浓度的摸索
2.4.5 可溶性重组蛋白的制备及鉴定
2.4.5.1 包涵体蛋白的纯化与溶解
2.4.5.2 重组蛋白的溶解、复性及鉴定
2.4.6 目的蛋白的Western Blotting鉴定
2.5 高免血清的制备
2.5.1 重组蛋白抗原的制备
2.5.2 免疫程序
2.5.3 ELISA法检测抗原免疫原性
2.5.4 Western Blotting法检测抗体特异性
3 结果
3.1 扬州鹅IFN-α成熟肽基因的扩增
3.2 克隆质粒pET32a-mGoIFN-α的鉴定
3.3 重组蛋白的表达鉴定及条件优化
3.3.1 重组蛋白pET32a-mGoIFN-α的表达
3.3.2 诱导时间的优化
3.3.3 IPTG最佳浓度的优化
3.4 扬州鹅IFN-α成熟蛋白的纯化
3.5 扬州鹅IFN-α成熟蛋白的Western Blotting鉴定
3.6 扬州鹅IFN-α成熟蛋白多克隆抗体效价检测
3.7 鼠抗血清的Western Blotting检测
4 讨论
4.1 载体与宿主菌的选择
4.2 表达蛋白的纯化
4.3 扬州鹅IFN-α的免疫原性
第六章 扬州鹅IFN-α基因的真核表达及抗病毒活性检测
1 材料
1.1 细胞与毒株
1.2 表达载体
1.3 仪器设备
1.4 主要试剂及其配制
1.4.1 培养基
1.4.2 粗提质粒试剂
1.4.3 核酸电泳试剂
1.4.4 感受态细胞制备试剂
1.4.5 细胞培养试剂
2 方法
2.1 扬州鹅IFN-α真核表达重组质粒的构建与鉴定
2.1.1 目的基因的制备
2.1.2 载体pcDNA3.1（-）的准备
2.1.3 目的片段与pcDNA3.1（-）载体的连接
2.1.4 感受态细胞的制备与连接产物的转化
2.1.5 重组质粒的筛选与鉴定
2.1.5.1 阳性重组质粒的筛选
2.1.5.2 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α的鉴定
2.2 扬州鹅IFN-α重组蛋白在细胞中的表达
2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α转染细胞
2.2.1.1 提取重组pcDNA3.1-GoIFN-α的质粒
2.2.1.2 细胞的制备
2.2.1.3 转染细胞
2.2.2 pcDNA3.1-GoIFN-α表达情况检测
2.3 扬州鹅重组pcDNA3.1-GoIFN-α抗VSV活性检测
2.3.1 鹅胚成纤维细胞的制备
2.3.2 水疱性口炎病毒的扩增与保存
2.3.3 VSV效价的测定
2.3.4 重组扬州鹅IFN-a抗病毒活性测定
3 结果
3.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α的鉴定
3.2 扬州鹅IFN-α基因在GEFs中的表达检测
3.3 扬州鹅IFN-α抗VSV病毒活性检测
4 讨论
4.1 扬州鹅IFN-α外源基因在鹅成纤维细胞中的表达
4.2 干扰素的抗病毒活性检测
结论
参考文献
作者简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组狮头鹅α干扰素的制备及其抗病毒活性[J]. 郑晓灵,刘艳芬,陈绍红,刘铀. 中国兽医科学. 2010(07)
[2]广西鹅γ干扰素基因的克隆与序列分析[J]. 胡丽萍,胡晓静,付薇,徐贤坤,何丹,刘棋,熊毅. 广西农业科学. 2010(06)
[3]鸭干扰素成熟片段基因的原核表达及其表达产物抗鸭瘟强毒活性检测[J]. 龚永强,程安春,汪铭书,杨梅,张瑶,陈斌. 中国兽医杂志. 2008(07)
[4]狮头鹅α-干扰素基因的克隆与遗传分析[J]. 郑晓灵,卢曦,刘艳芬,陈绍红,杨乐乐,刘铀. 中国畜牧兽医. 2008(06)
[5]基因枪轰击注射鸭α-干扰素基因疫苗对免疫鸭抗鸭瘟强毒感染的影响[J]. 周雪,程安春,汪铭书,杨梅,段坤,卢菲,程志萍,刘闯,陈孝跃,陈斌. 中国兽医科学. 2007(07)
[6]禽类干扰素的研究进展[J]. 郝春丽,康孟佼,田兆龙,柴丽娜,陈恩林,王泽霖. 中国兽药杂志. 2007(06)
[7]干扰素生物学特性及应用研究进展[J]. 王斌斌,王贵平,李春玲,莫内. 广东畜牧兽医科技. 2007(03)
[8]我国鹅业快速发展中存在问题的思考与对策[J]. 赵万里. 中国家禽. 2007(09)
[9]鸭α-干扰素真核表达质粒的构建及其对DVH弱毒苗免疫鸭细胞免疫调节作用研究[J]. 刘闯,程安春,汪铭书,陈斌,程志萍,段坤,杨梅,周雪,陈孝跃. 四川农业大学学报. 2007(01)
[10]复合干扰素在大肠杆菌中的高效表达与传代稳定性[J]. 赵伟,姚文兵,王岷,田浤,高向东,郭寅龙. 中国药科大学学报. 2007(01)
本文编号：3097630
【文章来源】：南京师范大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：102 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
图表清单
缩略词表
第一章 干扰素的研究概况
1 干扰素的分类及特征
2 干扰素的分子结构及特点
3 干扰素的产生与作用特性
3.1 干扰素受体
3.2 干扰素的信号转导与基因调控
3.3 干扰素诱生剂
4 干扰素的生物学功能
4.1 抗病毒活性
4.2 抗肿瘤活性
4.3 抗寄生虫活性
4.4 免疫调节活性
4.5 免疫佐剂活性
第二章 禽类干扰素的研究进展
第三章 研究的目的和意义
第四章 扬州鹅IFN-α基因的克隆与生物信息学分析
1 材料
1.1 实验动物
1.2 表达载体与菌株
1.3 仪器设备
1.4 主要试剂及其配制
1.4.1 培养基
1.4.2 总RNA的提取与细胞培养所需试剂
1.4.3 粗提质粒试剂
1.4.4 核酸电泳试剂
1.4.5 感受态细胞制备试剂
2 方法
2.1 扬州鹅IFN-α基因的RT-PCR扩增
2.1.1 引物设计与合成
2.1.2 提取扬州鹅外周血总RNA
2.1.2.1 提取经刀豆素（ConA）诱导培养的鹅外周血淋巴细胞的总RNA
2.1.2.2 提取未经诱导培养的鹅外周血淋巴细胞的总RNA
2.1.2.3 提取鹅外周血淋巴细胞中总RNA
2.1.2.4 提取鹅外周全血中的总RNA
2.1.3 RT-PCR扩增扬州鹅IFN-α全长基因
2.1.3.1 GoIFN-α基因的反转录（RT）
2.1.3.2 GoIFN-α全长基因的PCR扩增
2.1.4 扩增产物的纯化
2.2 扬州鹅IFN-α基因的T-载体克隆与鉴定
2.2.1 IFN-α基因与pGEM-T easy的连接
2.2.2 感受态细胞的制备及连接产物的转化
2.2.2.1 DH5a感受态细饱的制备
2.2.2.2 连接产物转化感受态细胞
2.2.3 转化菌落的筛选与鉴定
2.2.3.1 阳性重组质粒的筛选
2.2.3.2 重组质粒pGEM-T-GoIFN-α的鉴定
3 结果
3.1 扬州鹅IFN-α全基因的扩增
3.2 克隆质粒pGEM-T-GoIFN-α的鉴定
3.3 扬州鹅IFN-α基因的生物信息学分析
3.3.1 扬州鹅IFN-α核苷酸序列测序结果
3.3.2 扬州鹅IFN-α氨基酸序列测序结果
3.3.3 扬州鹅IFN-α同源性分析
3.3.4 扬州鹅IFN-α进化树分析
4 讨论
4.1 RNA提取方法的分析
4.2 扬州鹅IFN-α同源性等生物信息学分析
第五章 扬州鹅IFN-α基因的原核表达与高免血清的制备
1 材料
1.1 实验动物
1.2 表达载体与菌株
1.3 仪器设备
1.4 主要试剂及其配制
1.4.1 培养基
1.4.2 粗提质粒试剂
1.4.3 核酸电泳试剂
1.4.4 感受态细胞制备试剂
1.4.5 原核表达所需试剂
1.4.6 蛋白质电泳和Western Blotting所需试剂
1.4.7 ELISA试剂
2 方法
2.1 扬州鹅IFN-α成熟肽基因的RT-PCR
2.1.1 引物设计与合成
2.1.2 RT-PCR扩增扬州鹅IFN-α成熟肽基因
2.1.2. 1 GoIFN-α基因的反转录（RT）
2.1.2.2 GoIFN-α成熟肽基因的PCR扩增
2.1.3 扩增产物的纯化
2.2 载体pET32a（+）质粒提取、酶切与回收纯化
2.3 扬州鹅IFN-α成熟肽基因的原核表达载体的构建
2.3.1 目的片段与pET32a（+）载体的连接
2.3.2 感受态细胞的制备与连接产物的转化
2.3.3 重组质粒的筛选与鉴定
2.3.3.1 阳性重组质粒的筛选
2.3.3.2 重组质粒pET32a-mGoIFN-α的鉴定
2.4 重组蛋白的诱导表达
2.4.1 重组质粒pET32a-mGoIFN-α转化表达菌
2.4.2 工程菌的诱导表达
2.4.3 SDS-PAGE电泳
2.4.4 表达条件的优化
2.4.4.1 诱导时间的摸索
2.4.4.2 IPTG最佳浓度的摸索
2.4.5 可溶性重组蛋白的制备及鉴定
2.4.5.1 包涵体蛋白的纯化与溶解
2.4.5.2 重组蛋白的溶解、复性及鉴定
2.4.6 目的蛋白的Western Blotting鉴定
2.5 高免血清的制备
2.5.1 重组蛋白抗原的制备
2.5.2 免疫程序
2.5.3 ELISA法检测抗原免疫原性
2.5.4 Western Blotting法检测抗体特异性
3 结果
3.1 扬州鹅IFN-α成熟肽基因的扩增
3.2 克隆质粒pET32a-mGoIFN-α的鉴定
3.3 重组蛋白的表达鉴定及条件优化
3.3.1 重组蛋白pET32a-mGoIFN-α的表达
3.3.2 诱导时间的优化
3.3.3 IPTG最佳浓度的优化
3.4 扬州鹅IFN-α成熟蛋白的纯化
3.5 扬州鹅IFN-α成熟蛋白的Western Blotting鉴定
3.6 扬州鹅IFN-α成熟蛋白多克隆抗体效价检测
3.7 鼠抗血清的Western Blotting检测
4 讨论
4.1 载体与宿主菌的选择
4.2 表达蛋白的纯化
4.3 扬州鹅IFN-α的免疫原性
第六章 扬州鹅IFN-α基因的真核表达及抗病毒活性检测
1 材料
1.1 细胞与毒株
1.2 表达载体
1.3 仪器设备
1.4 主要试剂及其配制
1.4.1 培养基
1.4.2 粗提质粒试剂
1.4.3 核酸电泳试剂
1.4.4 感受态细胞制备试剂
1.4.5 细胞培养试剂
2 方法
2.1 扬州鹅IFN-α真核表达重组质粒的构建与鉴定
2.1.1 目的基因的制备
2.1.2 载体pcDNA3.1（-）的准备
2.1.3 目的片段与pcDNA3.1（-）载体的连接
2.1.4 感受态细胞的制备与连接产物的转化
2.1.5 重组质粒的筛选与鉴定
2.1.5.1 阳性重组质粒的筛选
2.1.5.2 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α的鉴定
2.2 扬州鹅IFN-α重组蛋白在细胞中的表达
2.2.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α转染细胞
2.2.1.1 提取重组pcDNA3.1-GoIFN-α的质粒
2.2.1.2 细胞的制备
2.2.1.3 转染细胞
2.2.2 pcDNA3.1-GoIFN-α表达情况检测
2.3 扬州鹅重组pcDNA3.1-GoIFN-α抗VSV活性检测
2.3.1 鹅胚成纤维细胞的制备
2.3.2 水疱性口炎病毒的扩增与保存
2.3.3 VSV效价的测定
2.3.4 重组扬州鹅IFN-a抗病毒活性测定
3 结果
3.1 重组质粒pcDNA3.1-GoIFN-α的鉴定
3.2 扬州鹅IFN-α基因在GEFs中的表达检测
3.3 扬州鹅IFN-α抗VSV病毒活性检测
4 讨论
4.1 扬州鹅IFN-α外源基因在鹅成纤维细胞中的表达
4.2 干扰素的抗病毒活性检测
结论
参考文献
作者简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]重组狮头鹅α干扰素的制备及其抗病毒活性[J]. 郑晓灵,刘艳芬,陈绍红,刘铀. 中国兽医科学. 2010(07)
[2]广西鹅γ干扰素基因的克隆与序列分析[J]. 胡丽萍,胡晓静,付薇,徐贤坤,何丹,刘棋,熊毅. 广西农业科学. 2010(06)
[3]鸭干扰素成熟片段基因的原核表达及其表达产物抗鸭瘟强毒活性检测[J]. 龚永强,程安春,汪铭书,杨梅,张瑶,陈斌. 中国兽医杂志. 2008(07)
[4]狮头鹅α-干扰素基因的克隆与遗传分析[J]. 郑晓灵,卢曦,刘艳芬,陈绍红,杨乐乐,刘铀. 中国畜牧兽医. 2008(06)
[5]基因枪轰击注射鸭α-干扰素基因疫苗对免疫鸭抗鸭瘟强毒感染的影响[J]. 周雪,程安春,汪铭书,杨梅,段坤,卢菲,程志萍,刘闯,陈孝跃,陈斌. 中国兽医科学. 2007(07)
[6]禽类干扰素的研究进展[J]. 郝春丽,康孟佼,田兆龙,柴丽娜,陈恩林,王泽霖. 中国兽药杂志. 2007(06)
[7]干扰素生物学特性及应用研究进展[J]. 王斌斌,王贵平,李春玲,莫内. 广东畜牧兽医科技. 2007(03)
[8]我国鹅业快速发展中存在问题的思考与对策[J]. 赵万里. 中国家禽. 2007(09)
[9]鸭α-干扰素真核表达质粒的构建及其对DVH弱毒苗免疫鸭细胞免疫调节作用研究[J]. 刘闯,程安春,汪铭书,陈斌,程志萍,段坤,杨梅,周雪,陈孝跃. 四川农业大学学报. 2007(01)
[10]复合干扰素在大肠杆菌中的高效表达与传代稳定性[J]. 赵伟,姚文兵,王岷,田浤,高向东,郭寅龙. 中国药科大学学报. 2007(01)
本文编号：3097630
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