柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的诱导及耐药相关基因特性的初步分析
发布时间：2021-03-29 15:50
球虫病是世界上危害严重的寄生虫病之一,对养鸡业造成了巨大的经济损失。随着药物的广泛使用及不合理使用,耐药性成为无法避免的问题,但球虫耐药性形成的机制至今不清楚,也没有找到控制球虫产生耐药性的靶基因。本研究通过实验室诱导获得了柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药虫株,观察了盐霉素耐药株和敏感株子孢子和裂殖子的超微结构,分析了盐霉素耐药株和敏感株的差异表达基因,检测了3个鸡球虫田间分离株的耐药状况,利用单卵囊分离技术获得22个柔嫩艾美耳球虫盐霉素田间耐药株,对柠檬酸合酶（EtCS）、甲硫氨酸氨基肽酶（EtMetAP）、锚蛋白重复序列（EtANK）3个球虫耐药相关基因的特性进行了初步分析。1.柔嫩艾美耳球虫盐霉素耐药株的实验室诱导与电镜观察采用药物浓度递增法,以15 mg/kg（药物/饲料）为起始诱导浓度,经过24次传代,用鸡体药敏试验检测,获得对盐霉素60 mg/kg完全耐药的柔嫩艾美耳球虫耐药株。利用透射电镜观察了盐霉素耐药株子孢子和裂殖子的超微结构,发现耐药株虫体的形态变得不规则、细胞膜粗糙与肿胀、细胞核形状变得不规则甚至溶解、微线减少、支链淀粉增多等。2.柔嫩艾美耳球虫敏感株和耐药株的比较转录组...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
柔嫩艾美耳球虫敏感株和盐霉素耐药株子孢子和裂殖子超微结构
的总RNA是否可以用于建库。3.2.7.2敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子cDNA文库的构建和IlluminaHiSeqTM测序1）RNA样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子的mRNA。2）将mRNA变成短片段，用随机引物使其反转录成双链cDNA。3）纯化cDNA，进行末端修复、加A尾并连接测序接头，选择片段大小，富集获得cDNA文库。4）将文库稀释成1ng/μL，插入片段合格后，用qPCR定量文库的浓度，确保质量。5）文库合格后进行测序，具体流程见图3-1。图3-1建库测序流程Figure3-1Databasebuildingandsequencingprocess3.2.7.3敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子测序数据生物信息分析将测序获得的数据转化成序列，通过测序错误率分布检查，A/T/G/C含量分布检查，去除低质量、有接头的reads等获得cleanreads进行质量评估。将获得的cleanreads与柔嫩艾美耳球虫基因组v8.1（www.toxodb.org）（REIDetal，2014）进行对比，对基因表达水平、相关性、差异表达水平进行分析，具体的流程见图3-2.
中国农业科学院硕士学位论文第三章柔嫩艾美耳球虫敏感株与盐霉素耐药株差异基因的论筛选与验证22图3-2生物信息分析流程Figure3-2Bioinformaticsanalysisprocess3.2.8敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子差异表达基因的验证3.2.8.1敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子RNA的提取参考2.2.7提取敏感株和耐药株的子孢子和第二代裂殖子。3.2.8.2敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子基因组DNA的去除及RNA的纯化1）去除基因组DNA的实验体系如表3-3所示。表3-3实验体系Table3-3Systemfortheexperiment试剂体积总RNA30μgRNaseInhibitor2μL10×DNaseΙbufferi5μLDNaseΙ(RNaseFree)2μLRNase-FreeWater11μLTotal50μL2）上述溶液吹打混匀，于37℃水浴锅中孵育30min，轻微离心混匀，冰上静置5min。3）参照RNAeasyMiniKit试剂盒使用说明书纯化RNA。3.2.8.3敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子cDNA的合成及纯化表3-4实验体系Table3-4Systemfortheexperiment试剂体积总RNA11μgRangdomprimer1μLTotal12μL
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡球虫病流行病学及防治[J]. 张万胜. 畜牧兽医科学(电子版). 2020(03)
[2]含有喹啉结构片段的杂合体及其抗耐药疟疾活性(二)[J]. 卢勇,徐志. 国外医药(抗生素分册). 2019(06)
[3]京海黄鸡柔嫩艾美耳球虫感染后盲肠转录组分析[J]. 于海亮,邹文斌,王晓慧,林雨鑫,戴国俊,张涛,张跟喜,谢恺舟,王金玉,施会强. 生物技术通报. 2019(11)
[4]鸡球虫耐药性研究进展[J]. 郝振凯,毕菲菲,韩贞艳,于咏兰,索勋,刘贤勇. 中国兽医杂志. 2019(06)
[5]四川部分地区鸡球虫分离株对11种抗球虫药物的耐药性调查[J]. 黄仪娟,王新秋,林瑞庆,刘丽丹,曾莉,刘园,黄仕凤,欧瑶瑶,苏嘉丽,翁亚彪. 动物医学进展. 2019(03)
[6]鸡球虫湖南醴陵分离株的药物敏感性试验[J]. 刘瑞良. 湖南畜牧兽医. 2018(02)
[7]吡啶类化合物在抗耐多药结核领域的研究进展[J]. 李川,徐闫,解小兵,官建国,高川. 国外医药(抗生素分册). 2018(01)
[8]淀粉酶在畜禽饲料中的应用研究进展[J]. 唐小懿,马杰,陈清华,王兴吉. 饲料研究. 2017(11)
[9]茶树EGCG合成过程相关的Ankyrin基因的克隆与表达分析[J]. 郑世仲,林玉玲,孙平,赖钟雄,林金科. 热带作物学报. 2016(07)
[10]柔嫩艾美耳球虫对盐酸氟乙基硫胺素耐药性的诱导研究[J]. 覃宗华,李俊健,彭晓娟,区煜荣,李云峰. 中国兽药杂志. 2016(03)
博士论文
[1]氢溴酸常山酮抗柔嫩艾美耳球虫作用研究[D]. 张德福.浙江大学 2012
[2]地克珠利抗鸡柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子作用机理研究[D]. 周变华.中国农业科学院 2010
[3]油菜柠檬酸合酶与柠檬酸裂解酶基因克隆及功能研究[D]. 童晋.中国农业科学院 2009
[4]枯草芽孢杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶基因的克隆与功能研究[D]. 吕鸿雁.中国协和医科大学 2002
硕士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫晚熟系盐霉素抗药株的选育[D]. 林贤.广西大学 2014
[2]鸡源性多重耐药沙门氏菌转座子与耐药相关性分析[D]. 王丹.东北农业大学 2013
[3]安徽三个地区柔嫩艾美尔球虫耐药性分析[D]. 王中宝.安徽农业大学 2013
[4]一氧化氮对桃果实三羧酸循环相关酶活性及蛋白质结构的影响[D]. 马春媚.山东农业大学 2013
[5]鸡体实验法及同工酶谱分析检测柔嫩艾美耳球虫的耐药性[D]. 王凤.安徽农业大学 2010
[6]4株柔嫩艾美耳球虫耐药性检测及同工酶分析[D]. 张祝明.安徽农业大学 2006
[7]三种鸡球虫PCR检测方法的建立及十株巨型艾美耳球虫ITS-1序列分析[D]. 辛玲.扬州大学 2005
本文编号：3107791
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
柔嫩艾美耳球虫敏感株和盐霉素耐药株子孢子和裂殖子超微结构
的总RNA是否可以用于建库。3.2.7.2敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子cDNA文库的构建和IlluminaHiSeqTM测序1）RNA样品检测合格后，用带有Oligo（dT）的磁珠，通过A-T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子的mRNA。2）将mRNA变成短片段，用随机引物使其反转录成双链cDNA。3）纯化cDNA，进行末端修复、加A尾并连接测序接头，选择片段大小，富集获得cDNA文库。4）将文库稀释成1ng/μL，插入片段合格后，用qPCR定量文库的浓度，确保质量。5）文库合格后进行测序，具体流程见图3-1。图3-1建库测序流程Figure3-1Databasebuildingandsequencingprocess3.2.7.3敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子测序数据生物信息分析将测序获得的数据转化成序列，通过测序错误率分布检查，A/T/G/C含量分布检查，去除低质量、有接头的reads等获得cleanreads进行质量评估。将获得的cleanreads与柔嫩艾美耳球虫基因组v8.1（www.toxodb.org）（REIDetal，2014）进行对比，对基因表达水平、相关性、差异表达水平进行分析，具体的流程见图3-2.
中国农业科学院硕士学位论文第三章柔嫩艾美耳球虫敏感株与盐霉素耐药株差异基因的论筛选与验证22图3-2生物信息分析流程Figure3-2Bioinformaticsanalysisprocess3.2.8敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子差异表达基因的验证3.2.8.1敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子RNA的提取参考2.2.7提取敏感株和耐药株的子孢子和第二代裂殖子。3.2.8.2敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子基因组DNA的去除及RNA的纯化1）去除基因组DNA的实验体系如表3-3所示。表3-3实验体系Table3-3Systemfortheexperiment试剂体积总RNA30μgRNaseInhibitor2μL10×DNaseΙbufferi5μLDNaseΙ(RNaseFree)2μLRNase-FreeWater11μLTotal50μL2）上述溶液吹打混匀，于37℃水浴锅中孵育30min，轻微离心混匀，冰上静置5min。3）参照RNAeasyMiniKit试剂盒使用说明书纯化RNA。3.2.8.3敏感株和盐霉素耐药株子孢子和第二代裂殖子cDNA的合成及纯化表3-4实验体系Table3-4Systemfortheexperiment试剂体积总RNA11μgRangdomprimer1μLTotal12μL
【参考文献】：
期刊论文
[1]鸡球虫病流行病学及防治[J]. 张万胜. 畜牧兽医科学(电子版). 2020(03)
[2]含有喹啉结构片段的杂合体及其抗耐药疟疾活性(二)[J]. 卢勇,徐志. 国外医药(抗生素分册). 2019(06)
[3]京海黄鸡柔嫩艾美耳球虫感染后盲肠转录组分析[J]. 于海亮,邹文斌,王晓慧,林雨鑫,戴国俊,张涛,张跟喜,谢恺舟,王金玉,施会强. 生物技术通报. 2019(11)
[4]鸡球虫耐药性研究进展[J]. 郝振凯,毕菲菲,韩贞艳,于咏兰,索勋,刘贤勇. 中国兽医杂志. 2019(06)
[5]四川部分地区鸡球虫分离株对11种抗球虫药物的耐药性调查[J]. 黄仪娟,王新秋,林瑞庆,刘丽丹,曾莉,刘园,黄仕凤,欧瑶瑶,苏嘉丽,翁亚彪. 动物医学进展. 2019(03)
[6]鸡球虫湖南醴陵分离株的药物敏感性试验[J]. 刘瑞良. 湖南畜牧兽医. 2018(02)
[7]吡啶类化合物在抗耐多药结核领域的研究进展[J]. 李川,徐闫,解小兵,官建国,高川. 国外医药(抗生素分册). 2018(01)
[8]淀粉酶在畜禽饲料中的应用研究进展[J]. 唐小懿,马杰,陈清华,王兴吉. 饲料研究. 2017(11)
[9]茶树EGCG合成过程相关的Ankyrin基因的克隆与表达分析[J]. 郑世仲,林玉玲,孙平,赖钟雄,林金科. 热带作物学报. 2016(07)
[10]柔嫩艾美耳球虫对盐酸氟乙基硫胺素耐药性的诱导研究[J]. 覃宗华,李俊健,彭晓娟,区煜荣,李云峰. 中国兽药杂志. 2016(03)
博士论文
[1]氢溴酸常山酮抗柔嫩艾美耳球虫作用研究[D]. 张德福.浙江大学 2012
[2]地克珠利抗鸡柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子作用机理研究[D]. 周变华.中国农业科学院 2010
[3]油菜柠檬酸合酶与柠檬酸裂解酶基因克隆及功能研究[D]. 童晋.中国农业科学院 2009
[4]枯草芽孢杆菌中甲硫氨酸氨基肽酶基因的克隆与功能研究[D]. 吕鸿雁.中国协和医科大学 2002
硕士论文
[1]柔嫩艾美耳球虫晚熟系盐霉素抗药株的选育[D]. 林贤.广西大学 2014
[2]鸡源性多重耐药沙门氏菌转座子与耐药相关性分析[D]. 王丹.东北农业大学 2013
[3]安徽三个地区柔嫩艾美尔球虫耐药性分析[D]. 王中宝.安徽农业大学 2013
[4]一氧化氮对桃果实三羧酸循环相关酶活性及蛋白质结构的影响[D]. 马春媚.山东农业大学 2013
[5]鸡体实验法及同工酶谱分析检测柔嫩艾美耳球虫的耐药性[D]. 王凤.安徽农业大学 2010
[6]4株柔嫩艾美耳球虫耐药性检测及同工酶分析[D]. 张祝明.安徽农业大学 2006
[7]三种鸡球虫PCR检测方法的建立及十株巨型艾美耳球虫ITS-1序列分析[D]. 辛玲.扬州大学 2005
本文编号：3107791
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