PLAG1基因对牛胎儿生长发育的调控机制研究
发布时间：2021-03-30 20:47
动物大多从受精卵开始发育,通过细胞增殖和分化逐渐形成胚胎,继而形成胎儿,最终发育为成体。动物生长发育是遗传因素与环境共同作用的结果。对家畜的生长发育的研究有利于提高家畜的生产性能,提高畜牧业的效益。为了探索牛胎儿生长发育的机理,本研究选取牛体型的候选功能基因PLAG1作为研究的对象,通过研究PLAG1在体外成肌细胞及软骨细胞中的作用来初步阐明其对生长发育的调控机制。主要通过siRNA干扰、腺病毒感染过表达PLAG1、CCK8分析及mRNA-seq等方法,研究PLAG1对牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞及长骨软骨来源的软骨细胞的增殖与相关基因表达的影响,通过ChIP-qPCR研究PLAG1的靶基因并探究其作用机理。得到主要结果如下:1、通过胶原酶消化法分离3月龄的小牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞,在增殖期利用siRNA干扰PLAG1,在干扰1天后,干扰组GHR和INSR表达量都显著高于阴性对照组（P<0.05）,而IGF1R和IGF2表达量都显著低于阴性对照组（P<0.05）,在干扰2天后,干扰组仅有IGF1R和IGF2表达量显著低于阴性对照组（IGF1R P<0.01,IGF2...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
牛PLAG1-CHCHD7基因区间双向启动子的序列变体(JUMAetal.,2016)
中国农业科学院硕士学位论文第三章结果与分析22第三章结果与分析3.1牛胎儿成肌细胞的分离及培养结果本试验所使用的成肌细胞来自于3月龄大小的荷斯坦胎牛，剥离胎牛背最长肌组织，加入胶原酶消化过滤后得到单细胞悬液，接种于培养皿培养24h，取出在显微镜下观察，可以看到细胞呈贴壁式生长，细胞形态呈现三角形，如图3-1图a，继续培养至70-80%，细胞逐渐变为长梭形，如图3-1图b。图3-1牛胎儿肌肉来源的成肌细胞形态Fig.3-1Themorphologyofbovinefetalmusclederivedmyoblast注：Bar：100μm3.2干扰PLAG1对成肌细胞的影响结果3.2.1siRNA的设计及在成肌细胞中干扰效率的检测结果根据NCBI检索到的牛PLAG1mRNA序列及预测的可能转录本序列，于4条转录本的共有序列处设计3条小干扰RNA（siRNA），序列见表3-1。用脂质体法将siRNA转入成肌细胞，培养48h后收集细胞检测siRNA的干扰效率。由图3-2qPCR结果可以看出，三条siRNA中干扰效果最好的为siRNA-002,因此我们选择siRNA-002开展后续试验。siRNA-002干扰PLAG148h后细胞形态无明显的改变。表3-1siRNA的靶序列Table3-1TargetsequencesofsiRNAssiRNA名称（Name）序列Sequences（5"→3"）si-PLAG1_001GGAAGGAAGGACTTCCTCTsi-PLAG1_002GCTGAACCTCTACAACACTsi-PLAG1_003CAGCATTGGATTTCTCTCA
中国农业科学院硕士学位论文第三章结果与分析23图3-2成肌细胞中siRNA干扰效率检测Fig.3-2TheefficiencytestofsiRNAinterferenceinmyoblasts3.2.2干扰PLAG1对成肌细胞相关基因表达量的影响结果在成肌细胞增殖过程中干扰PLAG1的表达，并于干扰后的1天和2天分别收取细胞样品检测mRNA表达，可以发现PLAG1的表达量都有显著的下降。在干扰1天后，INSR和GHR表达量都显著高于阴性对照组（P<0.05），而IGF1R和IGF2表达量都显著低于阴性对照组（P<0.05），其他基因表达量无明显变化，如图3-3左图所示。而在干扰2天后，我们发现，干扰组仅有IGF1R和IGF2表达量显著低于阴性对照组（IGF1RP<0.01,IGF2P<0.05），而其他基因的表达量与对照组相比无明显差异，如图3-3右图所示。综合两天的结果来看，在干扰PLAG1后，表达量一直受到显著影响的基因是IGF1R和IGF2。图3-3干扰PLAG1后相关基因的mRNA相对表达水平Fig.3-3TherelativemRNAexpressionlevelafterinterferingwithsiPLAG1
【参考文献】：
期刊论文
[1]S100a10基因对小鼠前体脂肪细胞白色和棕色成脂分化的影响[J]. 任玲,胡鑫,邢义珅,王亚慧,李俊雅,张路培. 畜牧兽医学报. 2019(06)
[2]小鼠关节软骨表层细胞分离培养及鉴定[J]. 谭乔燕,王权,旷梁,谢杨丽,李灿,罗凤涛,杜晓兰,陈林. 国际骨科学杂志. 2018(05)
[3]马鹿茸间充质干细胞软骨分化过程表面标志物的特征性变化[J]. 王姗姗,郑永富,马梦婷,高庆华,韩春梅. 西北农业学报. 2016(10)
硕士论文
[1]牛肌内脂肪沉积相关候选基因S100A10和bta-miR-210的生物学功能研究[D]. 任玲.中国农业科学院 2019
[2]NCAGP基因对牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞有丝分裂和成肌分化的影响及机理研究[D]. 邢义珅.中国农业科学院 2018
本文编号：3110130
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
牛PLAG1-CHCHD7基因区间双向启动子的序列变体(JUMAetal.,2016)
中国农业科学院硕士学位论文第三章结果与分析22第三章结果与分析3.1牛胎儿成肌细胞的分离及培养结果本试验所使用的成肌细胞来自于3月龄大小的荷斯坦胎牛，剥离胎牛背最长肌组织，加入胶原酶消化过滤后得到单细胞悬液，接种于培养皿培养24h，取出在显微镜下观察，可以看到细胞呈贴壁式生长，细胞形态呈现三角形，如图3-1图a，继续培养至70-80%，细胞逐渐变为长梭形，如图3-1图b。图3-1牛胎儿肌肉来源的成肌细胞形态Fig.3-1Themorphologyofbovinefetalmusclederivedmyoblast注：Bar：100μm3.2干扰PLAG1对成肌细胞的影响结果3.2.1siRNA的设计及在成肌细胞中干扰效率的检测结果根据NCBI检索到的牛PLAG1mRNA序列及预测的可能转录本序列，于4条转录本的共有序列处设计3条小干扰RNA（siRNA），序列见表3-1。用脂质体法将siRNA转入成肌细胞，培养48h后收集细胞检测siRNA的干扰效率。由图3-2qPCR结果可以看出，三条siRNA中干扰效果最好的为siRNA-002,因此我们选择siRNA-002开展后续试验。siRNA-002干扰PLAG148h后细胞形态无明显的改变。表3-1siRNA的靶序列Table3-1TargetsequencesofsiRNAssiRNA名称（Name）序列Sequences（5"→3"）si-PLAG1_001GGAAGGAAGGACTTCCTCTsi-PLAG1_002GCTGAACCTCTACAACACTsi-PLAG1_003CAGCATTGGATTTCTCTCA
中国农业科学院硕士学位论文第三章结果与分析23图3-2成肌细胞中siRNA干扰效率检测Fig.3-2TheefficiencytestofsiRNAinterferenceinmyoblasts3.2.2干扰PLAG1对成肌细胞相关基因表达量的影响结果在成肌细胞增殖过程中干扰PLAG1的表达，并于干扰后的1天和2天分别收取细胞样品检测mRNA表达，可以发现PLAG1的表达量都有显著的下降。在干扰1天后，INSR和GHR表达量都显著高于阴性对照组（P<0.05），而IGF1R和IGF2表达量都显著低于阴性对照组（P<0.05），其他基因表达量无明显变化，如图3-3左图所示。而在干扰2天后，我们发现，干扰组仅有IGF1R和IGF2表达量显著低于阴性对照组（IGF1RP<0.01,IGF2P<0.05），而其他基因的表达量与对照组相比无明显差异，如图3-3右图所示。综合两天的结果来看，在干扰PLAG1后，表达量一直受到显著影响的基因是IGF1R和IGF2。图3-3干扰PLAG1后相关基因的mRNA相对表达水平Fig.3-3TherelativemRNAexpressionlevelafterinterferingwithsiPLAG1
【参考文献】：
期刊论文
[1]S100a10基因对小鼠前体脂肪细胞白色和棕色成脂分化的影响[J]. 任玲,胡鑫,邢义珅,王亚慧,李俊雅,张路培. 畜牧兽医学报. 2019(06)
[2]小鼠关节软骨表层细胞分离培养及鉴定[J]. 谭乔燕,王权,旷梁,谢杨丽,李灿,罗凤涛,杜晓兰,陈林. 国际骨科学杂志. 2018(05)
[3]马鹿茸间充质干细胞软骨分化过程表面标志物的特征性变化[J]. 王姗姗,郑永富,马梦婷,高庆华,韩春梅. 西北农业学报. 2016(10)
硕士论文
[1]牛肌内脂肪沉积相关候选基因S100A10和bta-miR-210的生物学功能研究[D]. 任玲.中国农业科学院 2019
[2]NCAGP基因对牛胎儿骨骼肌来源的成肌细胞有丝分裂和成肌分化的影响及机理研究[D]. 邢义珅.中国农业科学院 2018
本文编号：3110130
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