水牛精原干细胞的体外培养与鉴定及转基因干细胞的异种移植
发布时间：2021-03-31 02:17
通过研究培养条件（包括血清浓度、饲养层细胞及三种生长因子）对水牛精原干细胞（SSCs）增殖的影响,最终建立水牛SSCs体外增殖的培养体系。通过介导生长抑素RNA干扰的PB转座子转染SSCs,得到含目的基因片段的SSCs;在移植转基因SSCs至昆明鼠睾丸后,分析转基因SSCs的增殖与分化功能。该研究为克隆转基因水牛提供新途径；为SSCs的生物学特性、多潜能性及定向分化的表观遗传学和精子发生机理等研究提供技术平台；结合SSCs的冷冻保存,为水牛的种质资源保存提供新手段；为其他家畜和人的SSCs的研究提供理论参考。1.水牛精原干细胞的体外培养与分子标志探索水牛SSCs特异性分子标志的发展,体外培养条件的优化以及其多能性的保持,在水牛的选择性遗传修饰中具有重要的意义。本研究取4～5月龄杂交水牛（摩拉×沼泽,49条染色体）睾丸,经Western blot发现水牛睾丸中存在两种蛋白异构体（135kDa大片段和90kDa小片段）,CDH1为水牛精原干细胞的特异性分子标志；免疫组织化学分析发现水牛睾丸精原细胞上存在CDH1的表达,且在体细胞中无表达。纯化后的精原干细胞（流式分析纯化富集效率达到53%）...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
縮略语表
第一章 文献综述
1 精原干细胞内源性调节机制研究进展
1.1 精原干细胞的起源
1.2 精原干细胞的生物活性
1.3 SSC龛内因子
2 SSCs表面表型的研究进展
2.1 表面表型的初步理解
2.2 造血干细胞和SSCs表面表型的共性
2.3 GDNF的受体复合物作为一种特定的SSCs表型
2.4 水牛SSCs表面表型的研究进展
3 外源生长因子对精原干细胞自我更新的影响
3.1 GDNF影响SSCs的增殖和正常生精功能
3.2 啮齿动物SSCs的体外长期培养体系
3.3 GDNF与精原干细胞体外长期自我更新
3.4 bFGF和EGF与SSCs体外自我更新
3.5 其他体外培养添加物进展
4 生长抑素
5 PB转座子介导RNAi技术
6 SSCs移植介导转基因动物生产的研究进展
6.1 SSCs的移植
6.2 移植前转基因
7 本项目的研究目的和意义
第二章 水牛精原干细胞（SSCS）分子标志筛查与体外培养
1 引言
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要仪器和材料
2.1.3 主要试剂
2.2 方法
2.2.1 试剂配制
2.2.2 样品的采集
2.2.3 免疫组化
2.2.4 Western blot检测
2.2.5 精原细胞的分离
2.2.6 水牛精原干细胞的纯化
2.2.7 流式细胞分析
2.2.8 饲养层准备
2.2.9 精原干细胞体外培养
2.2.10 精原细胞克隆的增殖分析
2.2.11 免疫细胞化学
2.2.12 克隆分离和RT-PCR、qRT-PCR检测
2.2.13 供体细胞移植
2.2.14 统计分析
3 结果与讨论
3.1 CDH1的转录水平表达
3.2 水牛睾丸组织中CDH1定位
3.3 水牛睾丸组织CDH1蛋白表达
3.4 水牛SSCs的分离和纯化效率
3.5 体外培养的胚胎成纤维细胞（MEF）
3.6 清饲养层培养体系中水牛SSCs增殖和克隆数
3.7 生长因子培养体系中水牛SSCs增殖和克隆数
3.8 体外培养SSCs克隆中特异性分子标志表达
3.9 生长因子对SSCs克隆的分子标志mRNA水平表达的影响
3.10 水牛SSCs在受体睾丸中的定植
4 讨论
4.1 CDH1在水牛精原干细胞中的表达与定位
4.2 水牛SSCs纯化效果
4.3 水牛SSCs体外培养中增殖特性
4.4 血清与饲养层体外培养体系的优化
4.5 生长因子对水牛精原干细胞在体外增殖的影响
第三章 转基因载体的构建与功能验证
1 引言
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 试验动物和细胞
2.1.2 干扰载体
2.1.3 所用试剂
2.1.4 主要试剂盒
2.1.5 主要抗体
2.2 方法
2.2.1 SS基因RNA干扰载体构建
2.2.2 SS干扰质粒转染BHK-21细胞
2.2.3 细胞总RNA的提取及逆转录
2.2.4 qRT-PCR检测质粒在mRNA水平的干扰效率
2.2.5 生长抑素表达水平检测
2.2.6 流式检测转染后细胞凋亡
2.2.7 流式检测转染后细胞周期
2.2.8 转染后凋亡和周期相关蛋白检测
2.2.9 统计分析
3 结果与分析
3.1 生长抑素RNAi载体构建
3.1.1 设计及合成的shRNA
3.1.2 双链退火得到shRNA
3.1.3 ph1载体质粒验证结果
3.1.4 真核表达干扰质粒的鉴定结果
3.2 生长抑素干扰载体的转染结果
3.2.1 转染效果
3.2.2 所提总RNA的质量
3.2.3 细胞激素水平的干扰效率
3.2.4 细胞在mRNA水平的干扰效果
3.3 转染SS干扰质粒对BHK-21细胞的影响
3.3.1 转染对细胞周期的影响
3.3.2 转染对细胞凋亡的影响
3.3.3 转染对BHK-21细胞生长抑素受体的影响
4 讨论
4.1 关于干扰效果的讨论
4.2 干扰SS后BHK-21细胞凋亡和周期变化
4.3 干扰SS对BHK-21细胞SSTR的影响
5 小结
第四章 水牛SSCs的异种移植
1 引言
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器与耗材
2.1.3 动物
2.2 方法
2.2.1 检测昆明小鼠对白消安的剂量反应
2.2.2 移植
2.2.3 统计分析
3 结果与分析
3.1 剂量反应
3.1.1 受体小鼠的体重变化
3.1.2 受体小鼠睾酮水平变化
3.1.3 受体小鼠睾丸组织学变化
3.2 供体细胞准备
3.2.1 水牛SSCs的体外转染效果
3.2.2 供体细胞荧光镜检及移植
3.3 移植后的受体睾丸分析结果
3.3.1 受体睾丸中供体SSCs的增殖状况
3.3.2 受体睾丸中供体细胞PCR检测结果
4 讨论
4.1 白消安剂量优化
4.2 SSCs转基因途径
4.3 受体睾丸中供体SSCs鉴定
4.4 受体睾丸中供体SSCs的增殖和分化
5 结论
参考文献
研究创新点
不足
附录Ⅰ 重组ph1质粒测序图谱
附录Ⅱ 在读期间发表的学术论著/论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]生长抑素基因免疫对湖羊羔羊生长及GH和IGF-Ⅰ的影响[J]. 薛春林,茆达干,程瑞禾,方永飞,杨利国. 中国农业大学学报. 2006(04)
[2]RNAi-DNA稳定表达载体的构建与应用[J]. 周唏,张鹏辉. 现代医药卫生. 2005(24)
[3]影响基因疫苗免疫效果的因素[J]. 茆达干,杨利国,曹少先. 中国免疫学杂志. 2004(05)
[4]抑制素α（1～32）基因免疫对大鼠卵泡发育和生殖激素的影响[J]. 茆达干,杨利国,叶荣,姜勋平. 中国农业科学. 2003(12)
[5]生长抑素基因工程疫苗对生长肥育猪促生长效果试验[J]. 石旭东,殷辉林,张小琳. 养猪. 2001(04)
[6]几种因素对培养小鼠精原干细胞的影响[J]. 张学明,李子义,赖良学,文兴豪,李德雪,岳占碰,杜惜明. 中国兽医学报. 2001(05)
硕士论文
[1]新生牛精原干细胞体外增殖调控的研究[D]. 张仕强.西北农林科技大学 2007
本文编号：3110585
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
縮略语表
第一章 文献综述
1 精原干细胞内源性调节机制研究进展
1.1 精原干细胞的起源
1.2 精原干细胞的生物活性
1.3 SSC龛内因子
2 SSCs表面表型的研究进展
2.1 表面表型的初步理解
2.2 造血干细胞和SSCs表面表型的共性
2.3 GDNF的受体复合物作为一种特定的SSCs表型
2.4 水牛SSCs表面表型的研究进展
3 外源生长因子对精原干细胞自我更新的影响
3.1 GDNF影响SSCs的增殖和正常生精功能
3.2 啮齿动物SSCs的体外长期培养体系
3.3 GDNF与精原干细胞体外长期自我更新
3.4 bFGF和EGF与SSCs体外自我更新
3.5 其他体外培养添加物进展
4 生长抑素
5 PB转座子介导RNAi技术
6 SSCs移植介导转基因动物生产的研究进展
6.1 SSCs的移植
6.2 移植前转基因
7 本项目的研究目的和意义
第二章 水牛精原干细胞（SSCS）分子标志筛查与体外培养
1 引言
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 实验动物
2.1.2 主要仪器和材料
2.1.3 主要试剂
2.2 方法
2.2.1 试剂配制
2.2.2 样品的采集
2.2.3 免疫组化
2.2.4 Western blot检测
2.2.5 精原细胞的分离
2.2.6 水牛精原干细胞的纯化
2.2.7 流式细胞分析
2.2.8 饲养层准备
2.2.9 精原干细胞体外培养
2.2.10 精原细胞克隆的增殖分析
2.2.11 免疫细胞化学
2.2.12 克隆分离和RT-PCR、qRT-PCR检测
2.2.13 供体细胞移植
2.2.14 统计分析
3 结果与讨论
3.1 CDH1的转录水平表达
3.2 水牛睾丸组织中CDH1定位
3.3 水牛睾丸组织CDH1蛋白表达
3.4 水牛SSCs的分离和纯化效率
3.5 体外培养的胚胎成纤维细胞（MEF）
3.6 清饲养层培养体系中水牛SSCs增殖和克隆数
3.7 生长因子培养体系中水牛SSCs增殖和克隆数
3.8 体外培养SSCs克隆中特异性分子标志表达
3.9 生长因子对SSCs克隆的分子标志mRNA水平表达的影响
3.10 水牛SSCs在受体睾丸中的定植
4 讨论
4.1 CDH1在水牛精原干细胞中的表达与定位
4.2 水牛SSCs纯化效果
4.3 水牛SSCs体外培养中增殖特性
4.4 血清与饲养层体外培养体系的优化
4.5 生长因子对水牛精原干细胞在体外增殖的影响
第三章 转基因载体的构建与功能验证
1 引言
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 试验动物和细胞
2.1.2 干扰载体
2.1.3 所用试剂
2.1.4 主要试剂盒
2.1.5 主要抗体
2.2 方法
2.2.1 SS基因RNA干扰载体构建
2.2.2 SS干扰质粒转染BHK-21细胞
2.2.3 细胞总RNA的提取及逆转录
2.2.4 qRT-PCR检测质粒在mRNA水平的干扰效率
2.2.5 生长抑素表达水平检测
2.2.6 流式检测转染后细胞凋亡
2.2.7 流式检测转染后细胞周期
2.2.8 转染后凋亡和周期相关蛋白检测
2.2.9 统计分析
3 结果与分析
3.1 生长抑素RNAi载体构建
3.1.1 设计及合成的shRNA
3.1.2 双链退火得到shRNA
3.1.3 ph1载体质粒验证结果
3.1.4 真核表达干扰质粒的鉴定结果
3.2 生长抑素干扰载体的转染结果
3.2.1 转染效果
3.2.2 所提总RNA的质量
3.2.3 细胞激素水平的干扰效率
3.2.4 细胞在mRNA水平的干扰效果
3.3 转染SS干扰质粒对BHK-21细胞的影响
3.3.1 转染对细胞周期的影响
3.3.2 转染对细胞凋亡的影响
3.3.3 转染对BHK-21细胞生长抑素受体的影响
4 讨论
4.1 关于干扰效果的讨论
4.2 干扰SS后BHK-21细胞凋亡和周期变化
4.3 干扰SS对BHK-21细胞SSTR的影响
5 小结
第四章 水牛SSCs的异种移植
1 引言
2 材料和方法
2.1 材料
2.1.1 主要试剂
2.1.2 主要仪器与耗材
2.1.3 动物
2.2 方法
2.2.1 检测昆明小鼠对白消安的剂量反应
2.2.2 移植
2.2.3 统计分析
3 结果与分析
3.1 剂量反应
3.1.1 受体小鼠的体重变化
3.1.2 受体小鼠睾酮水平变化
3.1.3 受体小鼠睾丸组织学变化
3.2 供体细胞准备
3.2.1 水牛SSCs的体外转染效果
3.2.2 供体细胞荧光镜检及移植
3.3 移植后的受体睾丸分析结果
3.3.1 受体睾丸中供体SSCs的增殖状况
3.3.2 受体睾丸中供体细胞PCR检测结果
4 讨论
4.1 白消安剂量优化
4.2 SSCs转基因途径
4.3 受体睾丸中供体SSCs鉴定
4.4 受体睾丸中供体SSCs的增殖和分化
5 结论
参考文献
研究创新点
不足
附录Ⅰ 重组ph1质粒测序图谱
附录Ⅱ 在读期间发表的学术论著/论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]生长抑素基因免疫对湖羊羔羊生长及GH和IGF-Ⅰ的影响[J]. 薛春林,茆达干,程瑞禾,方永飞,杨利国. 中国农业大学学报. 2006(04)
[2]RNAi-DNA稳定表达载体的构建与应用[J]. 周唏,张鹏辉. 现代医药卫生. 2005(24)
[3]影响基因疫苗免疫效果的因素[J]. 茆达干,杨利国,曹少先. 中国免疫学杂志. 2004(05)
[4]抑制素α（1～32）基因免疫对大鼠卵泡发育和生殖激素的影响[J]. 茆达干,杨利国,叶荣,姜勋平. 中国农业科学. 2003(12)
[5]生长抑素基因工程疫苗对生长肥育猪促生长效果试验[J]. 石旭东,殷辉林,张小琳. 养猪. 2001(04)
[6]几种因素对培养小鼠精原干细胞的影响[J]. 张学明,李子义,赖良学,文兴豪,李德雪,岳占碰,杜惜明. 中国兽医学报. 2001(05)
硕士论文
[1]新生牛精原干细胞体外增殖调控的研究[D]. 张仕强.西北农林科技大学 2007
本文编号：3110585
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3110585.html
