禽类Piwill基因与piRNAs生物学功能的初步研究

发布时间：2021-03-31 02:52

　　Piwi （P-element induced wimpy testis）基因参与生殖干细胞自我更新、减数分裂、RNA沉默以及转录调控过程。在模式生物上,研究发现piRNAs （Piwi-interacting RNAs）介导PIWI蛋白的表观遗传调控和转录初水平调控过程是生殖干细胞维持、配子形成以及受精的关键因素,但有关家禽Piwi基因的研究报道甚少。PIWI蛋白虽然广泛存在于各种动物中,但大部分只局限在配子发生和胚胎发育早期表达,而且表达模式也不一致,影响了其对生殖过程的具体作用机制的探讨。就此而言,禽类配子、胚胎易于获取且便于人工操作,具有其他生物无可比拟的优越性,可为探讨PIWI蛋白如何发挥调控作用的具体机制提供研究平台。另外,作为人类主要的动物蛋白来源食品,家禽业生产正处于发展的关键时期,仍有不少问题亟待解决：一是繁殖力持续下降,商业品种中每年有5～12%的无精症鸡遭淘汰；二是如禽流感、白血病等一些RNA病毒,因其容易变异造成预防、治疗失败,给家禽产业带来了巨大的损失。本研究以中国地方鸡种——狼山鸡为研究对象,分别从基因克隆、基因表达、转录调控和功能抑制等4个方面对Piwi ... 

【文章来源】：扬州大学江苏省

【文章页数】：131 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
目录
第一章 文献综述
    1 Piwi基因的研究进展
        1.1 Argonaute蛋白家族
        1.2 Piwi基因的发现
        1.3 Piwi基因的生物学功能
        1.4 PIWI蛋白与非编码小RNA
    2 鸡基因组转座子概述
    3 禽类精子发生
        3.1 禽类的生殖器官
        3.2 精子发生
    4 真核生物基因的转录调控研究
        4.1 真核生物基因的转录调控元件
        4.2 真核生物基因的转录调控研究
    5 RNA干扰技术
        5.1 RNAi的发现
        5.2 RNAi的作用机制
        5.3 RNAi技术
    6 实时定量PCR技术
        6.1 Real-Time qPCR的几个常用术语
        6.2 Real-Time qPCR的检测方法
        6.3 Real-Time qPCR的数据分析方法
    7 本研究的目的和意义
第二章 鸡Piwil1基因的克隆及其时空表达分析
    1 引言
    2 实验材料
        2.1 实验动物
        2.2 主要仪器
        2.3 主要试剂
    3 实验方法
        3.1 样品采集与保存
        3.2 鸡原始生殖细胞（PGCs）的分离与鉴定
        3.3 鸡精原干细胞（SSCs）的分离与鉴定
        3.4 鸡睾丸生精细胞的分离与鉴定
        3.5 鸡成熟精子的纯化
        3.6 基因组DNA提取与质量检测
        3.7 性别鉴定
        3.8 总RNA提取与质量检测
        3.9 RT-PCR
        3.10 TA克隆
        3.11 RACE
        3.12 Real-Time qPCR
        3.13 生物信息学分析
        3.14 数据分析
    4 结果与分析
        4.1 鸡PGCs的鉴定结果
        4.2 鸡SSCs的鉴定结果
        4.3 鸡睾丸精原（母）细胞的鉴定结果
        4.4 鸡Piwil1基因的克隆及其生物信息学分析
        4.5 鸡Piwil1基因的组织、细胞表达特异性
        4.6 Piwil1基因在狼山鸡不同发育阶段不同组织的表达量分析
        4.7 Piwil1基因在狼山鸡胚胎期性腺组织中的表达量分析
    5 讨论
第三章 鸡Piwil1基因的转录调控分析
    1 引言
    2 实验材料
        2.1 实验动物
        2.2 主要仪器
        2.3 主要试剂
    3 实验方法
        3.1 基因组DNA提取与质量检测
        3.2 Piwil1基因启动子区系列缺失片段的扩增
        3.3 克隆测序
        3.4 Piwil1基因启动子区系列缺失片段表达载体的构建
        3.5 定点突变表达载体的构建
        3.6 无内毒素质粒的提取
        3.7 细胞转染
        3.8 荧光素酶活性检测
        3.9 数据处理
    4 结果与分析
        4.1 Piwil1基因启动子区系列缺失片段表达载体的鉴定
        4.2 细胞转染条件的优化
        4.3 Piwil1基因启动子活性分析
        4.4 CCAAT box和TCCC box转录元件的定点突变分析
    5 讨论
第四章 体外抑制鸡Piwil1基因的表达对转座子活性的影响
    1 引言
    2 实验材料
        2.1 实验动物
        2.2 主要仪器
        2.3 主要试剂
    3 实验方法
        3.1 pcDNA3.1（+）-Piwil1表达载体的构建
        3.2 Piwil1基因shRNA干扰表达载体的构建
        3.3 Piwil1基因miRNA干扰慢病毒表达载体的构建
        3.4 无内毒素质粒的提取
        3.5 慢病毒包装
        3.6 慢病毒滴度测定
        3.7 miRNA干扰质粒和高表达质粒共转染HEK293细胞
        3.8 质粒转染及慢病毒侵染HEK293细胞
        3.9 shRNA干扰质粒瞬时转染鸡PGCs细胞
        3.10 Western Blot检测
        3.11 细胞间接免疫荧光检测
        3.12 Real-Time qPCR
        3.13 数据分析
    4 结果与分析
        4.1 pcDNA3.1（+）-Piwil1表达载体的鉴定
        4.2 PIWIL1蛋白的细胞内表达
        4.3 miRNA干扰表达载体干扰效果的筛选
        4.4 慢病毒包装与滴度测定
        4.5 慢病毒干扰效果的初步验证
        4.6 体外抑制鸡Piwil1基因的表达对CR1转座子活性的影响
    5 讨论
第五章 鹌鹑Piwil1基因克隆和piRNAs的表达谱研究
    1 引言
    2 实验材料
        2.1 实验动物
        2.2 主要仪器
        2.3 主要试剂
    3 实验方法
        3.1 样品采集与保存
        3.2 总RNA提取与质量检测
        3.3 RT-PCR
        3.4 RACE
        3.5 Northern Blot检测
        3.6 Western Blot检测
        3.7 免疫沉淀反应
        3.8 Small RNA cDNA文库的制备与Solexa测序
        3.9 生物信息学分析
    4 结果与分析
        4.1 鹌鹑Piwil1基因的克隆与生物信息学分析
        4.2 鹌鹑Piwil1基因的组织表达特异性
        4.3 Small RNAs深度测序数据概述
        4.4 piRNAs比对分析
    5 讨论
全文结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录


【参考文献】：
期刊论文
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[3]鸡pilRNAs分子的克隆及表达规律分析[J]. 张颖,常国斌,陈蓉,戴爱琴,栾德琴,李建超,马腾,华登科,陈国宏.  畜牧兽医学报. 2012(06)
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[7]鸡脂蛋白酯酶基因启动子的克隆及活性分析[J]. 毕静,丁宁,王宁,李辉.  畜牧兽医学报. 2010(06)
[8]启动子序列克隆和功能分析方法的研究进展[J]. 杨晓娜,赵昶灵,李云,李会容,苏丽,周燕琼.  云南农业大学学报(自然科学版). 2010(02)
[9]家鸡CHD1基因PCR快速性别鉴定方法的建立及其在早期鸡胚中的应用[J]. 王嘉力,贾存灵,苏利红,魏泽辉.  家禽科学. 2009(12)
[10]PIWIL1在不同肿瘤细胞中的差异性表达[J]. 田瑞卿,刘民,李欣,汤华.  中国生物化学与分子生物学报. 2008(11)



本文编号：3110640