禽白血病抗原和抗体ELISA检测方法的建立
发布时间：2021-04-06 09:29
禽白血病（Avian Leukosis）是由禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus）引起的一种易传染的肿瘤性疾病。ALV能够引起鸡群患肿瘤性疾病,除了对鸡群造成直接危害外,还可导致鸡群免疫失败,继发感染,产蛋率降低等,给我国养禽业带来了巨大的损失。到目前为止,该病还没有研制出可用的疫苗和有效的治疗药物,只能采取净化措施控制病毒的传播。P27蛋白为ALV的衣壳蛋白、群特异性抗原,目前常运用ELISA方法监测P27抗原达到净化鸡群的目的。本研究中在原核表达技术的基础上制备重组P27蛋白,建立检测P27抗体的间接ELISA方法,并同时将P27蛋白作为免疫原免疫Balb/c小鼠和日本大耳白兔,分别制备单克隆抗体和多克隆抗体,建立检测P27抗原的夹心ELISA检测方法,为禽白血病的临床快速诊断提供了有效工具。具体内容包括：1.P27基因的原核表达ALV P27基因克隆至原核表达载体pET28a,构建pET28a-P27重组质粒,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG16℃过夜诱导获得以可溶形式高效表达的P27蛋白,对P27蛋白进行镍亲和层析纯化,并经SDS-PAGE以及w...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
縮略词表
第一章 文献综述
1 禽白血病病毒病原特性
1.1 禽白血病病毒形态特征
1.2 禽白血病病毒的理化性质
1.3 禽白血病病毒的分类
1.4 禽白血病病毒基因组结构
1.5 P27蛋白
1.6 禽白血病内、外源性病毒
2. 禽白血病病毒致病机理
3. 禽白血病病理学
4. 禽白血病流行病学
5. 禽白血病的检测方法及种群净化
5.1 禽白血病病毒的分离与鉴定
5.2 间接生物实验
5.3 PCR和RT-PCR
5.4 ELISA
5.5 种群净化
6. 研究的目的和意义
第二章 禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立
1 试验材料
1.1 毒株
1.2 质粒和血清
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
1.5 主要培养基和溶液的配置
1.5.1 抗生素
1.5.2 培养基类
1.5.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液
1.5.4 Western blot相关溶液
1.5.5 蛋白表达与检测的相关溶液
1.5.6 纯化蛋白相关溶液的配置
1.5.7 ELISA相关溶液
2 方法
2.1 P27基因的克隆
2.1.1 引物设计
2.1.2 P27基因的扩增
2.1.3 P27基因与克隆载体的连接
2.1.4 重组质粒的转化
2.1.5 对重组质粒进行鉴定
2.2 重组表达质粒pET28a-P27的构建及其鉴定
2.3 P27蛋白的诱导表达及蛋白的纯化
2.3.1 重组质粒的转化
2.3.2 P27蛋白诱导表达最佳条件的摸索
2.3.3 P27蛋白表达形式的鉴定
2.3.4 P27蛋白的纯化
2.3.5 P27蛋白的鉴定
2.4 间接ELISA检测方法的建立及其鉴定
2.4.1 间接ELISA检测方法的操作步骤
2.4.2 P27蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
2.4.3 P27蛋白最佳包被条件的确定
2.4.4 最佳封闭剂和封闭时间的确定
2.4.5 检测血清最佳作用时间的确定
2.4.6 酶标二抗最佳稀释度和最佳作用时间的确定
2.4.7 最佳显色时间的确定
2.4.8 阴阳性临界值的确定
2.4.9 特异性实验
2.4.10 敏感性实验
2.4.11 重复性实验
2.4.12 符合性实验
2.4.13 包被抗原保存期实验
3 结果
3.1 P27基因PCR扩增结果
3.2 pMD18-P27亚克隆重组质粒的鉴定
3.3 pET28a-P27重组表达质粒的鉴定
3.4 P27蛋白最佳诱导条件的摸索
3.5 P27蛋白表达形式的鉴定
3.6 P27蛋白的纯化及蛋白浓度
3.7 P27蛋白的western blot结果
3.8 禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立
3.8.1 P27蛋白最佳包被浓度和血清稀释度的确定
3.8.2 最佳包被条件的确定
3.8.3 最佳封闭剂和封闭时间的确定
3.8.4 被检血清最佳作用时间的确定
3.8.5 酶标二抗最佳稀释度和作用时间的确定
3.8.6 最佳显色时间的确定
3.8.7 间接ELISA方法临界值的确定
3.8.8 间接ELISA特异性
3.8.9 间接ELISA敏感性
3.8.10 间接ELISA重复性
3.8.11 间接ELISA符合性
3.8.12 间接ELISA包被抗原保存期时间的确定
4. 讨论
4.1 关于重组表达质粒pET28a-P27
4.2 关于P27蛋白的分析
4.3 间接ELISA影响因素分析
4.4 关于临界值的判定
4.5 间接ELISA检测方法的评价
5. 结论
第三章 禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立
1 试验材料
1.1 试验动物
1.2 蛋白与细胞
1.3 主要试剂与材料
1.4 主要仪器
1.5 主要溶液的配制
1.5.1 制备单克隆抗体相关溶液
1.5.2 杂交瘤细胞染色体计数相关溶液
1.5.3 纯化抗体相关溶液
1.5.4 抗体检测相关溶液
1.5.5 ELISA相关溶液
2 方法
2.1 P27单克隆抗体的制备
2.1.1 小鼠免疫
2.1.2 细胞融合
2.1.3 阳性杂交瘤的筛选和克隆
2.1.4 单克隆抗体的生产和纯化
2.1.5 单抗生物学特性鉴定
2.2 P27蛋白多克隆抗体的制备
2.2.1 日本大耳白兔的免疫
2.2.2 多克隆抗体的纯化
2.2.3 多克隆抗体的鉴定
2.3 夹心ELISA检测方法的建立及其鉴定
2.3.1 标准检测样品的选择
2.3.2 夹心ELISA方法的操作程序
2.3.3 捕获抗体的选择
2.3.4 捕获抗体和检测抗体最佳浓度的确定
2.3.5 酶标二抗最佳稀释度的确定
2.3.6 最佳显色时间的确定
2.3.7 标准阳性样品和标准阴性样品的确定
2.3.8 最佳封闭剂和封闭时间的确定
2.3.9 检测样品、多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定
2.3.10 阴阳性临界值的确定
2.3.11 标准曲线的确定
2.3.12 敏感性试验
2.3.13 特异性试验
2.3.14 重复性实验
2.3.15 符合性实验
3. 结果
3.1 抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的制备
3.1.1 免疫Balb/C小鼠血清效价的测定
3.1.2 杂交瘤细胞的建立
3.1.3 单抗的生物学性质鉴定
3.2 抗禽白血病病毒P27蛋白多克隆抗体的制备
3.2.1 免疫日本大耳白兔血清效价的测定
3.2.2 纯化后兔多抗SDS-PAGE分析及蛋白浓度的测定
3.2.3 兔多抗的western blot鉴定
3.3 禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立
3.3.1 标准样品的选择
3.3.2 捕获抗体的选择
3.3.3 捕获抗体最佳包被浓度和检测抗体最佳稀释浓度的确定
3.3.4 最佳酶标二抗稀释度的确定
3.3.5 最佳显色时间的确定
3.3.6 标准阳性对照和标准阴性对照的确定
3.3.7 最佳封闭剂和封闭时间的确定
3.3.8 最佳抗原、兔多抗和酶标二抗工作时间的确定
3.3.9 夹心ELISA临界值的确定
3.3.10 夹心ELISA标准曲线的确定
3.3.11 夹心ELISA敏感性试验
3.3.12 夹心ELISA特异性试验
3.3.13 夹心ELISA重复性试验
3.3.14 夹心ELISA符合性试验
4. 讨论
4.1 单抗有关的影响因素
4.2 多抗制备的影响因素
4.3 夹心ELISA影响因素的分析
4.4 夹心ELISA方法的评价
5. 结论
参考文献
致谢
本文编号：3121202
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
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摘要
Abstract
縮略词表
第一章 文献综述
1 禽白血病病毒病原特性
1.1 禽白血病病毒形态特征
1.2 禽白血病病毒的理化性质
1.3 禽白血病病毒的分类
1.4 禽白血病病毒基因组结构
1.5 P27蛋白
1.6 禽白血病内、外源性病毒
2. 禽白血病病毒致病机理
3. 禽白血病病理学
4. 禽白血病流行病学
5. 禽白血病的检测方法及种群净化
5.1 禽白血病病毒的分离与鉴定
5.2 间接生物实验
5.3 PCR和RT-PCR
5.4 ELISA
5.5 种群净化
6. 研究的目的和意义
第二章 禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立
1 试验材料
1.1 毒株
1.2 质粒和血清
1.3 主要试剂
1.4 主要仪器
1.5 主要培养基和溶液的配置
1.5.1 抗生素
1.5.2 培养基类
1.5.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液
1.5.4 Western blot相关溶液
1.5.5 蛋白表达与检测的相关溶液
1.5.6 纯化蛋白相关溶液的配置
1.5.7 ELISA相关溶液
2 方法
2.1 P27基因的克隆
2.1.1 引物设计
2.1.2 P27基因的扩增
2.1.3 P27基因与克隆载体的连接
2.1.4 重组质粒的转化
2.1.5 对重组质粒进行鉴定
2.2 重组表达质粒pET28a-P27的构建及其鉴定
2.3 P27蛋白的诱导表达及蛋白的纯化
2.3.1 重组质粒的转化
2.3.2 P27蛋白诱导表达最佳条件的摸索
2.3.3 P27蛋白表达形式的鉴定
2.3.4 P27蛋白的纯化
2.3.5 P27蛋白的鉴定
2.4 间接ELISA检测方法的建立及其鉴定
2.4.1 间接ELISA检测方法的操作步骤
2.4.2 P27蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定
2.4.3 P27蛋白最佳包被条件的确定
2.4.4 最佳封闭剂和封闭时间的确定
2.4.5 检测血清最佳作用时间的确定
2.4.6 酶标二抗最佳稀释度和最佳作用时间的确定
2.4.7 最佳显色时间的确定
2.4.8 阴阳性临界值的确定
2.4.9 特异性实验
2.4.10 敏感性实验
2.4.11 重复性实验
2.4.12 符合性实验
2.4.13 包被抗原保存期实验
3 结果
3.1 P27基因PCR扩增结果
3.2 pMD18-P27亚克隆重组质粒的鉴定
3.3 pET28a-P27重组表达质粒的鉴定
3.4 P27蛋白最佳诱导条件的摸索
3.5 P27蛋白表达形式的鉴定
3.6 P27蛋白的纯化及蛋白浓度
3.7 P27蛋白的western blot结果
3.8 禽白血病病毒P27蛋白间接ELISA检测方法的建立
3.8.1 P27蛋白最佳包被浓度和血清稀释度的确定
3.8.2 最佳包被条件的确定
3.8.3 最佳封闭剂和封闭时间的确定
3.8.4 被检血清最佳作用时间的确定
3.8.5 酶标二抗最佳稀释度和作用时间的确定
3.8.6 最佳显色时间的确定
3.8.7 间接ELISA方法临界值的确定
3.8.8 间接ELISA特异性
3.8.9 间接ELISA敏感性
3.8.10 间接ELISA重复性
3.8.11 间接ELISA符合性
3.8.12 间接ELISA包被抗原保存期时间的确定
4. 讨论
4.1 关于重组表达质粒pET28a-P27
4.2 关于P27蛋白的分析
4.3 间接ELISA影响因素分析
4.4 关于临界值的判定
4.5 间接ELISA检测方法的评价
5. 结论
第三章 禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立
1 试验材料
1.1 试验动物
1.2 蛋白与细胞
1.3 主要试剂与材料
1.4 主要仪器
1.5 主要溶液的配制
1.5.1 制备单克隆抗体相关溶液
1.5.2 杂交瘤细胞染色体计数相关溶液
1.5.3 纯化抗体相关溶液
1.5.4 抗体检测相关溶液
1.5.5 ELISA相关溶液
2 方法
2.1 P27单克隆抗体的制备
2.1.1 小鼠免疫
2.1.2 细胞融合
2.1.3 阳性杂交瘤的筛选和克隆
2.1.4 单克隆抗体的生产和纯化
2.1.5 单抗生物学特性鉴定
2.2 P27蛋白多克隆抗体的制备
2.2.1 日本大耳白兔的免疫
2.2.2 多克隆抗体的纯化
2.2.3 多克隆抗体的鉴定
2.3 夹心ELISA检测方法的建立及其鉴定
2.3.1 标准检测样品的选择
2.3.2 夹心ELISA方法的操作程序
2.3.3 捕获抗体的选择
2.3.4 捕获抗体和检测抗体最佳浓度的确定
2.3.5 酶标二抗最佳稀释度的确定
2.3.6 最佳显色时间的确定
2.3.7 标准阳性样品和标准阴性样品的确定
2.3.8 最佳封闭剂和封闭时间的确定
2.3.9 检测样品、多抗和酶标二抗最佳作用时间的确定
2.3.10 阴阳性临界值的确定
2.3.11 标准曲线的确定
2.3.12 敏感性试验
2.3.13 特异性试验
2.3.14 重复性实验
2.3.15 符合性实验
3. 结果
3.1 抗禽白血病病毒P27蛋白单克隆抗体的制备
3.1.1 免疫Balb/C小鼠血清效价的测定
3.1.2 杂交瘤细胞的建立
3.1.3 单抗的生物学性质鉴定
3.2 抗禽白血病病毒P27蛋白多克隆抗体的制备
3.2.1 免疫日本大耳白兔血清效价的测定
3.2.2 纯化后兔多抗SDS-PAGE分析及蛋白浓度的测定
3.2.3 兔多抗的western blot鉴定
3.3 禽白血病病毒P27蛋白夹心ELISA检测方法的建立
3.3.1 标准样品的选择
3.3.2 捕获抗体的选择
3.3.3 捕获抗体最佳包被浓度和检测抗体最佳稀释浓度的确定
3.3.4 最佳酶标二抗稀释度的确定
3.3.5 最佳显色时间的确定
3.3.6 标准阳性对照和标准阴性对照的确定
3.3.7 最佳封闭剂和封闭时间的确定
3.3.8 最佳抗原、兔多抗和酶标二抗工作时间的确定
3.3.9 夹心ELISA临界值的确定
3.3.10 夹心ELISA标准曲线的确定
3.3.11 夹心ELISA敏感性试验
3.3.12 夹心ELISA特异性试验
3.3.13 夹心ELISA重复性试验
3.3.14 夹心ELISA符合性试验
4. 讨论
4.1 单抗有关的影响因素
4.2 多抗制备的影响因素
4.3 夹心ELISA影响因素的分析
4.4 夹心ELISA方法的评价
5. 结论
参考文献
致谢
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