致病性坏死梭杆菌外膜蛋白提取和原核表达及免疫活性研究

发布时间：2021-04-07 14:24

　　坏死梭杆菌（Fusobacteriumnecrophorum，FN）是革兰氏阴性多形态厌氧菌，多存在于反刍动物坏死病灶中，引起人畜急性或慢性的坏死性疾病，是影响反刍动物健康的重要传染病之一。本研究采用改良的提取工艺提取FN的外膜蛋白（outermembraneproteins,OMP），分光光度计测定其浓度4.524mg/ml，SDS-PAGE电泳图谱显示集中在44.5kDa左右（OMP44.5），Westernblot分析显示，OMP44.5可以与兔抗血清结合，具有较好的免疫活性。通过小鼠攻毒实验和小鼠巨噬细胞的MTS实验发现OMP使小鼠脏器发生病变，细胞活力降低，表明OMP对小鼠细胞有毒性作用。在此基础上，利用PCR技术从FN基因组DNA中扩增OMP编码基因片段，将其克隆在pMD-18TSimple上并测序，测序结果与GenBank公布的基因序列比对同源性100%。构建pET-28a-OMP重组质粒转化到E.coliBL21（DE3）宿主菌中，IPTG诱导，镍柱纯化诱导表达的重组合蛋白，经SDS-PAGE和Westernblot鉴定，结果表明，OMP融合蛋白进行了有效表达并具有免疫... 

【文章来源】：江苏科技大学江苏省

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 绪论
    1.1 坏死梭杆菌
    1.2 坏死梭杆菌的研究现状
        1.2.1 流行病学
        1.2.2 病理变化
        1.2.3 致病机理
    1.3 细菌外膜蛋白的研究现状
        1.3.1 OMP的结构
        1.3.2 OMP的致病机理
        1.3.3 OMP与 LPS
        1.3.4 OMP的免疫原性
    1.4 结束语
第2章 坏死梭杆菌外膜蛋白的粗提取及免疫活性分析
    2.1 材料
        2.1.1 菌种
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 仪器设备
        2.1.4 实验动物
    2.2 方法
        2.2.1 菌种的复苏
        2.2.2 OMP的提取
        2.2.3 SDS-PAGE 鉴定
        2.2.4 非变性蛋白质电泳（ Native-page ）
        2.2.5 OMP含量测定
        2.2.6 Western blot
        2.2.7 小鼠体内接种试验
        2.2.8 接种小鼠病理学检测
    2.3 结果
        2.3.1 坏死梭杆菌的培养
        2.3.2 SDS-PAGE 鉴定
        2.3.3 非变性蛋白质电泳
        2.3.4 OMP含量
        2.3.5 Western blot分析
        2.3.6 毒性检测
        2.3.7 肝脏病理组织学检测
    2.4 讨论
        2.4.1 坏死梭杆菌的培养
        2.4.2 OMP的提取
        2.4.3 OMP的免疫活性与毒性
    2.5 本章小结
第3章 坏死梭杆菌外膜蛋白的原核表达及特性鉴定
    3.1 材料
        3.1.1 数据来源
        3.1.2 菌种和载体
        3.1.3 工具酶、试剂盒及主要试剂
        3.1.4 主要设备
    3.2 方法
        3.2.1 设计引物
        3.2.2 目的基因的扩增
        3.2.3 目的基因克隆与鉴定
        3.2.4 原核表达载体构建
        3.2.5 目的蛋白的诱导表达与检测
        3.2.6 重组蛋白和提取 OMP 对细胞的毒性
            3.2.6.1 培养细胞
            3.2.6.2 MTS 试验
    3.3 结果
        3.3.1 目的片段的克隆与鉴定
        3.3.2 重组表达质粒的鉴定
        3.3.3 诱导表达
        3.3.4 Western blot
        3.3.5 重组蛋白和提取 OMP 对细胞毒性试验
    3.4 讨论
        3.4.1 克隆质粒与表达质粒的构建
        3.4.2 阳性质粒的筛选
        3.4.3 诱导表达
        3.4.4 重组蛋白的免疫活性和对细胞的毒性
    3.5 本章小结
结论
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]牛分枝杆菌外膜蛋白基因ompA的原核表达及免疫活性分析[J]. 亓英芳,黄瑛,杜艳芬,刘慧芳,赫明雷,司微,倪洪波,王春来,刘思国.  中国动物传染病学报. 2009(04)
[2]肠致病性大肠杆菌外膜蛋白免疫保护性研究[J]. 李晓霞,邱玉玉,王海荣.  中国免疫学杂志. 2007(05)
[3]坏死梭杆菌病免疫学研究进展[J]. 苗利光,杨福合,刘艳环,王志刚.  动物医学进展. 2006(11)
[4]鹿源坏死梭杆菌毒力菌株FN（AB）94实验动物感染模型的建立[J]. 王克坚,苗立光,陈立志,刘晓颖,张洪涛,徐敏.  中国兽医学报. 2001(02)
[5]禽致病性大肠杆菌外膜蛋白SDS-PAGE分析[J]. 韦莉,杨兵.  北京农业科学. 1999(01)
[6]禽源大肠杆菌O2、O78分离株外膜蛋白型的研究[J]. 高菘,刘秀梵,张如宽.  中国兽医学报. 1996(03)
[7]产蛋鸡大肠杆菌性生殖道病感染途径探讨[J]. 朱中武,陈可毅,张晓梅,宁玲忠.  中国兽医科技. 1995(02)
[8]外膜蛋白菌苗的研究进展[J]. 李福胜,徐友梅.  国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册. 1993(01)
[9]鸡大肠杆菌致病力与某些生物特性的相关性探讨[J]. 赖平安,杜春辉.  中国兽医科技. 1992(08)

博士论文
[1]牛源致病性坏死梭杆菌分离鉴定及其白细胞毒素免疫特性研究[D]. 陈立志.吉林大学 2008
[2]牛羊腐蹄病坏死梭杆菌白细胞毒素重组亚单位疫苗的研究[D]. 郭东华.东北农业大学 2007

硕士论文
[1]鸡奇异变形杆菌的分离鉴定及生物学特性的研究[D]. 朱明华.山东农业大学 2010
[2]致病性坏死梭杆菌分子检测与基因分型[D]. 姚志利.中国农业科学院 2010
[3]致病性坏死梭杆菌FN5株白细胞毒素特性研究[D]. 冯二凯.江苏科技大学 2010
[4]兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及其外膜蛋白免疫效果的研究[D]. 肖海君.山东农业大学 2008



本文编号：3123659