与PCV2基因组DNA相互作用宿主细胞蛋白的筛选及其功能研究
发布时间：2021-04-08 04:47
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2, PCV2）基因组为单链环状DNA,包含两个主要开放阅读框。ORF1编码2个与病毒复制相关的蛋白（Rep和Rep’）,Rep由全长ORF1编码314个氨基酸（aa）组成,Rep’由ORF1转录剪接内含子而来,由178个aa组成。Rep与Rep’蛋白形成的复合体是病毒复制所必需的,在宿主细胞酶类分子的参与下,该病毒复制以滚环复制机制（Rolling-circle replication, RCR）完成的。由于PCV2基因组较小,编码蛋白数量有限,据此推测病毒复制需要宿主细胞酶类分子的参与,究竟宿主细胞哪类蛋白参与其中所知甚少。本研究通过酵母单杂交技术筛选宿主细胞中与PCV2复制相关的蛋白,从病毒宿主细胞-猪肾细胞株（PK-15）中初步鉴定出有4种蛋白与PCV2基因组茎环序列发生互作,这4种蛋白分别为配体相关蛋白复合体（AP2α2）、ETS相关的转录因子（Elf4）、铁硫束组装酶（ISCU）蛋白和肌动蛋白（p-actin）;进一步通过蛋白过表达及RNAi技术验证这些蛋白对PCV2病毒复制的调节作用。第一、与PCV2基因组茎环...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RCR溶炉模型(A);PCV的复制模型(B)
重组载体pAbAi-SL54双酶切和凝胶电泳表明，从重组质粒上切下了与莲环结构序列长度一致的片段（60 bp)(图2.1),表明目的顺式元件序列已成功与pAbAi载体连接。将酶切片段长度正确的重组质粒送测序鉴定，插入序列与基环寡聚核若酸序列完全一致且方向正确，将诱馆载体命名为 pAbAi-SL54。2. 2. 2诱馆酵母菌株AbA的最低使用浓度的确定菌落PCR鉴定结果（图2.2)表明获得了长度约为1.4 kb的目的片段，证明线性化的pAbAi-SL54株诱饼载体已整合到酵母YlHGold基因组中，成功获得了诱谓酵母菌株。将诱馆酵母涂布在含不同浓度AbA的SDAUra固体培养基上，当AbA浓度达到200ng/mL时，仍不能完全抑制酵母菌的生长，因此继续提高AbA浓度，当AbA的浓度提高到1000 ng/mL时
3.2.1目的基因的PCR扩増以PK-15细胞cDNA为模板，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，AP2(x2、Elf4和ISCU基因分别在预期位置2601 bp、1989 bp和919 bp处出现特异性条带，表明三种扩增产物正确（图3.1)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 黄立平,刘长明,危艳武,张朝霞,陆月华,郭龙军. 中国预防兽医学报. 2009(02)
[2]猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用[J]. 刘长明,张超范,危艳武,张朝霞,袁婧. 中国预防兽医学报. 2007(08)
[3]猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定[J]. 刘长明,张超范,危艳武,谭斌,陆月华,谷守林. 中国预防兽医学报. 2006(03)
[4]酵母单杂交体系——一种研究DNA-蛋白质相互作用的有效方法[J]. 廖名湘,方福德. 中国医学科学院学报. 2000(04)
本文编号：3124879
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
RCR溶炉模型(A);PCV的复制模型(B)
重组载体pAbAi-SL54双酶切和凝胶电泳表明，从重组质粒上切下了与莲环结构序列长度一致的片段（60 bp)(图2.1),表明目的顺式元件序列已成功与pAbAi载体连接。将酶切片段长度正确的重组质粒送测序鉴定，插入序列与基环寡聚核若酸序列完全一致且方向正确，将诱馆载体命名为 pAbAi-SL54。2. 2. 2诱馆酵母菌株AbA的最低使用浓度的确定菌落PCR鉴定结果（图2.2)表明获得了长度约为1.4 kb的目的片段，证明线性化的pAbAi-SL54株诱饼载体已整合到酵母YlHGold基因组中，成功获得了诱谓酵母菌株。将诱馆酵母涂布在含不同浓度AbA的SDAUra固体培养基上，当AbA浓度达到200ng/mL时，仍不能完全抑制酵母菌的生长，因此继续提高AbA浓度，当AbA的浓度提高到1000 ng/mL时
3.2.1目的基因的PCR扩増以PK-15细胞cDNA为模板，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，AP2(x2、Elf4和ISCU基因分别在预期位置2601 bp、1989 bp和919 bp处出现特异性条带，表明三种扩增产物正确（图3.1)。
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗猪圆环病毒2型Cap蛋白中和性单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 黄立平,刘长明,危艳武,张朝霞,陆月华,郭龙军. 中国预防兽医学报. 2009(02)
[2]猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用[J]. 刘长明,张超范,危艳武,张朝霞,袁婧. 中国预防兽医学报. 2007(08)
[3]猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定[J]. 刘长明,张超范,危艳武,谭斌,陆月华,谷守林. 中国预防兽医学报. 2006(03)
[4]酵母单杂交体系——一种研究DNA-蛋白质相互作用的有效方法[J]. 廖名湘,方福德. 中国医学科学院学报. 2000(04)
本文编号：3124879
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