流产布鲁氏菌毒力基因筛选鉴定及其功能研究
发布时间：2021-04-10 05:31
布鲁氏菌病是一种重要的人畜共患病，其病原布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性菌，感染后，主要引起动物流产和人的波状热。布鲁氏菌无经典的毒力因子，如质粒，外毒素，溶细胞素，荚膜或内毒素特性的脂多糖分子，其毒力主要体现在入侵宿主细胞并在胞内存活的能力，基于此，布鲁氏菌能感染宿主建立慢性感染，较难被清除，因此研究布鲁氏菌建立慢性感染和胞内存活所需的基因对于阐明布鲁氏菌的致病机制具有重要意义。本研究主要采用信号标签转座子随机突变技术和基因芯片技术分别筛选鉴定布鲁氏菌建立慢性感染和胞内存活所需基因，为研究布鲁氏菌致病机制提供理论研究资料。本研究中，我们通过逐步施压的方法，诱导流产布鲁氏菌S2308产生萘啶酸抗性（Nal）作为筛选标记，以抗性菌株为亲本，构建含8个信号标签的转座子随机突变库，共含有突变株3759株，以BABL/c小鼠为动物模型，共筛选2048株突变株，获得89株减毒株。通过步移PCR鉴定了24株减毒株的插入失活基因，其中获得一株粗糙型布鲁氏菌，鉴定为rfbE基因失活，rfbE基因为布鲁氏菌O-抗原转运系统ATP结合蛋白，为进一步研究该基因的功能，我们通过定向缺失技术构建流产布鲁氏...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中国农业科学院博上学位论文评阅人、答辩委员会签名表
摘要
Abstract
图表清单
英文缩略表
第一章 引言
1.1 布鲁氏菌研究概况
1.1.1 概况
1.1.2 分类
1.1.3 传播途径
1.2 布鲁氏菌主要毒力基因研究进展
1.2.1 脂多糖（LPS）
1.2.2 四型分泌系统（T4SS）
1.2.3 双组份调控系统（BvrR/BvrS）
1.2.4 环β-1,2-葡聚糖
1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）
1.2.6 过氧化氢酶
1.2.7 其他毒力因子
1.3 细菌毒力基因筛选方法
1.3.1 生物信息学方法
1.3.2 基因芯片技术
1.3.3 转座子随机突变技术
1.3.4 体内诱导技术
1.3.5 差异荧光诱导
1.3.6 体内诱导抗原技术
1.3.7 转录序列选择性捕获技术
1.3.8 其他筛选方法
1.4 本研究的目的和意义
第二章 信号标签随机突变库筛选布鲁氏菌减毒突变株
2.1 材料与方法
2.1.1 菌株与试验动物
2.1.2 试剂
2.1.3 仪器
2.1.4 溶液配制
2.1.5 流产布鲁氏菌萘啶酸抗性菌株的筛选及毒力鉴定
2.1.6 标签质粒 pUTmini-Tn5-Tag 的构建
2.1.7 PCR 依赖的信号标签的交叉反应性
2.1.8 信号标签随机突变库的构建
2.1.9 减毒突变株的筛选
2.1.10 减毒突变株插入失活基因鉴定
2.2 结果
2.2.1 流产布鲁氏菌诱导产生 Nal 抗性并保持原菌株对小鼠的毒力
2.2.2 成功构建 8 个标签转座子质粒且 PCR 交叉反应为阴性
2.2.3 标签突变库的构建
2.2.4 减毒突变株的筛选
2.2.5 减毒突变株的失活基因鉴定
2.3 讨论
第三章 流产布鲁氏菌 rfbE 缺失株的构建及致病性分析
3.1 材料与方法
3.1.1 菌株、细胞系及实验动物
3.1.2 试剂
3.1.3 仪器
3.1.4 溶液配制
3.1.5 自杀性质粒和互补质粒的构建
3.1.6 缺失株和互补株的构建
3.1.7 细菌表型鉴定
3.1.8 生长曲线的测定
3.1.9 粘附入侵和胞内存活试验
3.1.10 间接免疫荧光试验
3.1.11 细胞死亡鉴定
3.1.12 对小鼠致病性分析
3.2 结果
3.2.1 质粒构建结果
3.2.2 缺失株和互补株构建结果
3.2.3 细菌表型鉴定结果
3.2.4 生长曲线测定结果
3.2.5 粘附入侵结果
3.2.6 细胞胞内存活结果
3.2.7 细胞坏死鉴定
3.2.8 小鼠致病性分析结果
3.3 讨论
第四章 布鲁氏菌 rfbE 缺失株酸休克蛋白上调机制及功能
4.1 材料和方法
4.1.1 菌株
4.1.2 细胞
4.1.3 试剂
4.1.4 主要仪器
4.1.5 溶液配制
4.1.6 细菌 RNA 提取
4.1.7 基因芯片分析及 qRT-PCR 验证
4.1.8 质粒构建
4.1.9 Asp24 蛋白表达
4.1.10 Asp24 兔抗血清的制备
4.1.11 布鲁氏菌突变株衍生株的构建
4.1.12 细菌组分提取及免疫印迹试验
4.1.13 细菌粘附入侵以及胞内存活测定方法
4.1.14 细胞毒力及死亡类型鉴定
4.1.15 细菌酸性诱导及耐酸性试验
4.2 结果
4.2.1 Asp24 蛋白在 rfbE 缺失株中出现明显上调表达
4.2.2 Asp24 蛋白上调表达与 O-抗原在 rfbE 缺失株中胞内合成和积累有关
4.2.3 Asp24 蛋白上调表达不是 rfbE 缺失株导致巨噬细胞肿胀和坏死的原因
4.2.4 Asp24 蛋白在酸性条件下被诱导表达但与细菌酸性抵抗力无关
4.2.5 改变 Asp24 蛋白表达量影响布鲁氏菌在宿主细胞内的存活
4.3 讨论
第五章 基因芯片筛选流产布鲁氏菌胞内存活相关基因
5.1 材料与方法
5.1.1 菌种
5.1.2 细胞
5.1.3 试剂
5.1.4 仪器
5.1.5 溶液配制
5.1.6 细菌收集
5.1.7 细菌总 RNA 提取
5.1.8 标记和纯化 RNA
5.1.9 杂交
3.1.10 芯片洗涤与扫描
5.1.11 数据处理和分析
5.1.12 qRT-PCR 验证芯片结果
5.1.13 主要差异表达基因功能分类
5.2 结果
5.2.1 RNA 质量分析
5.2.2 确定差异表达基因
5.2.3 差异基因热图和聚类分析
5.2.4 差异基因参与的代谢通路分析
5.2.5 qRT-PCR 的验证和主要差异表达基因的功能分类
5.3 讨论
第六章 流产布鲁氏菌 ddp 基因缺失株的构建及致病性分析
6.1 材料与方法
6.1.1 菌株与细胞系
6.1.2 试剂
6.1.3 仪器
6.1.4 溶液配制
6.1.5 自杀性质粒的构建
6.1.6 缺失株构建
6.1.7 细菌表型鉴定
6.1.8 细菌 LPS 提取与免疫印迹鉴定
6.1.9 ddp 缺失株粘附入侵试验
6.1.10 ddp 缺失巨噬细胞内存活试验
6.1.11 ddp 缺失株细胞毒性试验
6.1.12 ddp 缺失株感染巨噬细胞细胞因子转录水平测定
6.1.13 ddp 缺失株对小鼠致病性分析
6.2 结果
6.2.1 ddp 基因生物信息学分析
6.2.2 缺失株的构建结果
6.2.3 细菌表型分析结果
6.2.4 免疫印迹鉴定细菌 LPS 结果
6.2.5 细菌粘附入侵结果
6.2.6 细菌胞内存活结果
6.2.7 细胞毒性试验结果
6.2.8 ddp 缺失株诱导巨噬细胞免疫相关因子转录水平分析
6.2.9 ddp 缺失株对小鼠的致病性分析结果
6.3 讨论
第七章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]实时荧光定量PCR检测RAW264.7巨噬细胞中Th1/Th2型细胞因子转录水平方法的建立及初步应用[J]. 单雪芹,韩先干,张敏,宋军,刘海文,田明星,潘玲,丁铲,周锦萍,于圣青. 细胞与分子免疫学杂志. 2013(04)
[2]运用体内表达技术筛选霍乱弧菌感染成年小鼠体内诱导表达基因[J]. 陈建东,张竞,阚飙,钟增涛,朱军. 南京农业大学学报. 2010(01)
[3]肺炎链球菌体内诱导基因的筛选及初步鉴定[J]. 孟江萍,尹一兵,张雪梅,黄远帅,蓝锴. 微生物学报. 2006(04)
[4]高通量药物靶位基因筛选的策略与方法[J]. 徐伟文,李文全. 中国药学杂志. 2002(04)
本文编号：3129053
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：106 页
【学位级别】：博士
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中国农业科学院博上学位论文评阅人、答辩委员会签名表
摘要
Abstract
图表清单
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第一章 引言
1.1 布鲁氏菌研究概况
1.1.1 概况
1.1.2 分类
1.1.3 传播途径
1.2 布鲁氏菌主要毒力基因研究进展
1.2.1 脂多糖（LPS）
1.2.2 四型分泌系统（T4SS）
1.2.3 双组份调控系统（BvrR/BvrS）
1.2.4 环β-1,2-葡聚糖
1.2.5 超氧化物歧化酶（SOD）
1.2.6 过氧化氢酶
1.2.7 其他毒力因子
1.3 细菌毒力基因筛选方法
1.3.1 生物信息学方法
1.3.2 基因芯片技术
1.3.3 转座子随机突变技术
1.3.4 体内诱导技术
1.3.5 差异荧光诱导
1.3.6 体内诱导抗原技术
1.3.7 转录序列选择性捕获技术
1.3.8 其他筛选方法
1.4 本研究的目的和意义
第二章 信号标签随机突变库筛选布鲁氏菌减毒突变株
2.1 材料与方法
2.1.1 菌株与试验动物
2.1.2 试剂
2.1.3 仪器
2.1.4 溶液配制
2.1.5 流产布鲁氏菌萘啶酸抗性菌株的筛选及毒力鉴定
2.1.6 标签质粒 pUTmini-Tn5-Tag 的构建
2.1.7 PCR 依赖的信号标签的交叉反应性
2.1.8 信号标签随机突变库的构建
2.1.9 减毒突变株的筛选
2.1.10 减毒突变株插入失活基因鉴定
2.2 结果
2.2.1 流产布鲁氏菌诱导产生 Nal 抗性并保持原菌株对小鼠的毒力
2.2.2 成功构建 8 个标签转座子质粒且 PCR 交叉反应为阴性
2.2.3 标签突变库的构建
2.2.4 减毒突变株的筛选
2.2.5 减毒突变株的失活基因鉴定
2.3 讨论
第三章 流产布鲁氏菌 rfbE 缺失株的构建及致病性分析
3.1 材料与方法
3.1.1 菌株、细胞系及实验动物
3.1.2 试剂
3.1.3 仪器
3.1.4 溶液配制
3.1.5 自杀性质粒和互补质粒的构建
3.1.6 缺失株和互补株的构建
3.1.7 细菌表型鉴定
3.1.8 生长曲线的测定
3.1.9 粘附入侵和胞内存活试验
3.1.10 间接免疫荧光试验
3.1.11 细胞死亡鉴定
3.1.12 对小鼠致病性分析
3.2 结果
3.2.1 质粒构建结果
3.2.2 缺失株和互补株构建结果
3.2.3 细菌表型鉴定结果
3.2.4 生长曲线测定结果
3.2.5 粘附入侵结果
3.2.6 细胞胞内存活结果
3.2.7 细胞坏死鉴定
3.2.8 小鼠致病性分析结果
3.3 讨论
第四章 布鲁氏菌 rfbE 缺失株酸休克蛋白上调机制及功能
4.1 材料和方法
4.1.1 菌株
4.1.2 细胞
4.1.3 试剂
4.1.4 主要仪器
4.1.5 溶液配制
4.1.6 细菌 RNA 提取
4.1.7 基因芯片分析及 qRT-PCR 验证
4.1.8 质粒构建
4.1.9 Asp24 蛋白表达
4.1.10 Asp24 兔抗血清的制备
4.1.11 布鲁氏菌突变株衍生株的构建
4.1.12 细菌组分提取及免疫印迹试验
4.1.13 细菌粘附入侵以及胞内存活测定方法
4.1.14 细胞毒力及死亡类型鉴定
4.1.15 细菌酸性诱导及耐酸性试验
4.2 结果
4.2.1 Asp24 蛋白在 rfbE 缺失株中出现明显上调表达
4.2.2 Asp24 蛋白上调表达与 O-抗原在 rfbE 缺失株中胞内合成和积累有关
4.2.3 Asp24 蛋白上调表达不是 rfbE 缺失株导致巨噬细胞肿胀和坏死的原因
4.2.4 Asp24 蛋白在酸性条件下被诱导表达但与细菌酸性抵抗力无关
4.2.5 改变 Asp24 蛋白表达量影响布鲁氏菌在宿主细胞内的存活
4.3 讨论
第五章 基因芯片筛选流产布鲁氏菌胞内存活相关基因
5.1 材料与方法
5.1.1 菌种
5.1.2 细胞
5.1.3 试剂
5.1.4 仪器
5.1.5 溶液配制
5.1.6 细菌收集
5.1.7 细菌总 RNA 提取
5.1.8 标记和纯化 RNA
5.1.9 杂交
3.1.10 芯片洗涤与扫描
5.1.11 数据处理和分析
5.1.12 qRT-PCR 验证芯片结果
5.1.13 主要差异表达基因功能分类
5.2 结果
5.2.1 RNA 质量分析
5.2.2 确定差异表达基因
5.2.3 差异基因热图和聚类分析
5.2.4 差异基因参与的代谢通路分析
5.2.5 qRT-PCR 的验证和主要差异表达基因的功能分类
5.3 讨论
第六章 流产布鲁氏菌 ddp 基因缺失株的构建及致病性分析
6.1 材料与方法
6.1.1 菌株与细胞系
6.1.2 试剂
6.1.3 仪器
6.1.4 溶液配制
6.1.5 自杀性质粒的构建
6.1.6 缺失株构建
6.1.7 细菌表型鉴定
6.1.8 细菌 LPS 提取与免疫印迹鉴定
6.1.9 ddp 缺失株粘附入侵试验
6.1.10 ddp 缺失巨噬细胞内存活试验
6.1.11 ddp 缺失株细胞毒性试验
6.1.12 ddp 缺失株感染巨噬细胞细胞因子转录水平测定
6.1.13 ddp 缺失株对小鼠致病性分析
6.2 结果
6.2.1 ddp 基因生物信息学分析
6.2.2 缺失株的构建结果
6.2.3 细菌表型分析结果
6.2.4 免疫印迹鉴定细菌 LPS 结果
6.2.5 细菌粘附入侵结果
6.2.6 细菌胞内存活结果
6.2.7 细胞毒性试验结果
6.2.8 ddp 缺失株诱导巨噬细胞免疫相关因子转录水平分析
6.2.9 ddp 缺失株对小鼠的致病性分析结果
6.3 讨论
第七章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]实时荧光定量PCR检测RAW264.7巨噬细胞中Th1/Th2型细胞因子转录水平方法的建立及初步应用[J]. 单雪芹,韩先干,张敏,宋军,刘海文,田明星,潘玲,丁铲,周锦萍,于圣青. 细胞与分子免疫学杂志. 2013(04)
[2]运用体内表达技术筛选霍乱弧菌感染成年小鼠体内诱导表达基因[J]. 陈建东,张竞,阚飙,钟增涛,朱军. 南京农业大学学报. 2010(01)
[3]肺炎链球菌体内诱导基因的筛选及初步鉴定[J]. 孟江萍,尹一兵,张雪梅,黄远帅,蓝锴. 微生物学报. 2006(04)
[4]高通量药物靶位基因筛选的策略与方法[J]. 徐伟文,李文全. 中国药学杂志. 2002(04)
本文编号：3129053
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