基于体内调控细菌Ⅵ型分泌蛋白的减毒沙门氏菌裂解系统的构建
发布时间：2021-04-11 18:45
重组细菌载体疫苗,尤其是重组减毒沙门氏菌疫苗（Recombinant Attenuated Salmonella Vaccine,RASV）,因其可以有效地激发宿主产生粘膜免疫反应、体液免疫反应以及细胞免疫反应的特点,已经被广泛用作递送保护性抗原和核酸疫苗的载体。RASV是具有构完整细菌结构的活疫苗,因此重组疫苗携带的外源性抗原或真核表达质粒难以从细菌中释放出来而发挥作用,而在体内残留的沙门氏菌也会造成生物污染。为解决上述问题,本研究基于细菌Ⅵ型分泌系统（TypeⅥSecretion System,T6SS）分泌的肽聚糖水解蛋白,设计了一系列由体内诱导启动子调控的裂解组合,并最终筛选出了一组由Mg2+调控的体内裂解系统去递送外源抗原。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的Ⅵ型分泌系统能够分泌两种肽聚糖水解因子Tse1和Tse3,这两种蛋白能够破坏细菌细胞壁结构造成细菌裂解死亡。本研究首先选用了三种内源性表达启动子,分别是限Mg2+调控启动子PpagC、限Fe2+调控启动子Pviu B以及组成型表达启动子araC P
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Fe2+调控的裂解系统[31]
西南大学硕士学位论文18图3-1调控裂解质粒的构建模型图Fig.3-1Diagramofmodelillustratingtheconstructionforregulatedlysisplasmids（1）细菌基因组的抽提为了获取启动子PpagC（来源于S.Typhimurium），启动子PviuB（来源于V.cholerae），裂解基因tse1和tse3（来源于P.aeruginosa），需要提取相应菌株的基因组以作为扩增模板。分别将UK-1菌株、V.choleraeO1菌株、P.aeruginosaPAO1菌株接种划线到固体LB培养基上进行复苏，次日，挑选平板上的单菌落分别接种于5mL液体LB中过夜37℃振荡培养；第二日，各吸取1mL菌液，按照细菌基因组抽提试剂盒（天根，目录DP302）的说明书进行基因组的抽提，抽提完的基因组经核酸蛋白测定仪（NanoDrop2000，ThermoScientific）测定浓度后保存于-20℃。（2）细菌质粒的提取为了获取信号肽序列SS1（blass）和SS2（pelBss），以及表达载体，需要从相应宿主菌中提取质粒以作为扩增模板。将保存pYA4088质粒的χ9241菌株接种至LB固体培养基复苏，保存pYA4518质粒的χ7232菌株接种至LB（Cm+）固体培养基复苏，保存pSW220质粒的χ6097菌株接种至LB（Cm+）固体培养基复苏；次日挑取各培养基上的单菌落分别在液体LB（Cm+或无Cm+）的培养基扩增培养，分别取1mL菌液，按照质粒小提试剂盒（天根，目录DP103）的说明书进行操作。（3）目的片段的扩增PCR所需的引物、模板以及扩增产物见表3-6，PCR反应体系见表3-7，PCR反应条件见3-8。表3-6PCR所需引物、模板及PCR产物
第3章调控裂解组合的构建、表达与筛选253.3结果与分析3.3.1裂解质粒的构建（1）为了获得所需的各个基因片段，首先使用PCR的方法将启动子PpagC和PviuB，信号肽序列SS1和SS2，裂解基因tse1和tse3以及载体片段V1和V2从相应的模板中扩增出来，其中V2载体中带有Ptrc序列。经电泳鉴定，各个PCR产物大小均符合预期。其中SS1有6个片段SS1-1~SS6-1，SS2有6个片段SS2-1~SS2-6，PpagC有2个片段PpagC-1和PpagC-2，PviuB有两个片段PviuB-1和PviuB-2，各个重复片段之间除了用于融合PCR的接口序列不同外，其他序列均一致。目的片段PCR鉴定结果见图3-2。图3-2目的片段的PCR扩增Fig.3-2PCRproductsoftargetedfragments.(A)M:DNAMarker;1~6:SS2-1~SS2-6;7~12:SS1-6~SS1-6(B)M:DNAMarker;1:PpagC-1;2:PpagC-2;3:PviuB-1;4:PviuB-2;5:tse1-1;6:tse1-2;7:tse3-1;8:tse3-2;9:V1;10:V2（2）获得纯化的目的片段序列之后，按照本章介绍的方法进行PCR片段的融合。首先进行两个片段之间的融合，即将SS1/SS2和tse1/tse3片段进行融合，分别获得融合片段SS1-tse1-1~SS1-tse1-3、SS1-tse3-1~SS1-tse3-3、SS2-tse1-1~SS2-
【参考文献】：
期刊论文
[1]裂解系统在细菌载体疫苗中的应用[J]. 唐一波,刘青,李沛,罗红艳,孔庆科. 生物工程学报. 2019(03)
本文编号：3131767
【文章来源】：西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Fe2+调控的裂解系统[31]
西南大学硕士学位论文18图3-1调控裂解质粒的构建模型图Fig.3-1Diagramofmodelillustratingtheconstructionforregulatedlysisplasmids（1）细菌基因组的抽提为了获取启动子PpagC（来源于S.Typhimurium），启动子PviuB（来源于V.cholerae），裂解基因tse1和tse3（来源于P.aeruginosa），需要提取相应菌株的基因组以作为扩增模板。分别将UK-1菌株、V.choleraeO1菌株、P.aeruginosaPAO1菌株接种划线到固体LB培养基上进行复苏，次日，挑选平板上的单菌落分别接种于5mL液体LB中过夜37℃振荡培养；第二日，各吸取1mL菌液，按照细菌基因组抽提试剂盒（天根，目录DP302）的说明书进行基因组的抽提，抽提完的基因组经核酸蛋白测定仪（NanoDrop2000，ThermoScientific）测定浓度后保存于-20℃。（2）细菌质粒的提取为了获取信号肽序列SS1（blass）和SS2（pelBss），以及表达载体，需要从相应宿主菌中提取质粒以作为扩增模板。将保存pYA4088质粒的χ9241菌株接种至LB固体培养基复苏，保存pYA4518质粒的χ7232菌株接种至LB（Cm+）固体培养基复苏，保存pSW220质粒的χ6097菌株接种至LB（Cm+）固体培养基复苏；次日挑取各培养基上的单菌落分别在液体LB（Cm+或无Cm+）的培养基扩增培养，分别取1mL菌液，按照质粒小提试剂盒（天根，目录DP103）的说明书进行操作。（3）目的片段的扩增PCR所需的引物、模板以及扩增产物见表3-6，PCR反应体系见表3-7，PCR反应条件见3-8。表3-6PCR所需引物、模板及PCR产物
第3章调控裂解组合的构建、表达与筛选253.3结果与分析3.3.1裂解质粒的构建（1）为了获得所需的各个基因片段，首先使用PCR的方法将启动子PpagC和PviuB，信号肽序列SS1和SS2，裂解基因tse1和tse3以及载体片段V1和V2从相应的模板中扩增出来，其中V2载体中带有Ptrc序列。经电泳鉴定，各个PCR产物大小均符合预期。其中SS1有6个片段SS1-1~SS6-1，SS2有6个片段SS2-1~SS2-6，PpagC有2个片段PpagC-1和PpagC-2，PviuB有两个片段PviuB-1和PviuB-2，各个重复片段之间除了用于融合PCR的接口序列不同外，其他序列均一致。目的片段PCR鉴定结果见图3-2。图3-2目的片段的PCR扩增Fig.3-2PCRproductsoftargetedfragments.(A)M:DNAMarker;1~6:SS2-1~SS2-6;7~12:SS1-6~SS1-6(B)M:DNAMarker;1:PpagC-1;2:PpagC-2;3:PviuB-1;4:PviuB-2;5:tse1-1;6:tse1-2;7:tse3-1;8:tse3-2;9:V1;10:V2（2）获得纯化的目的片段序列之后，按照本章介绍的方法进行PCR片段的融合。首先进行两个片段之间的融合，即将SS1/SS2和tse1/tse3片段进行融合，分别获得融合片段SS1-tse1-1~SS1-tse1-3、SS1-tse3-1~SS1-tse3-3、SS2-tse1-1~SS2-
【参考文献】：
期刊论文
[1]裂解系统在细菌载体疫苗中的应用[J]. 唐一波,刘青,李沛,罗红艳,孔庆科. 生物工程学报. 2019(03)
本文编号：3131767
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