稳定表达鹅源RIG-I的鸡胚成纤维细胞系的构建及鉴定
发布时间：2021-04-12 17:13
维甲酸诱导基因I型（retinoic acid inducible gene-I，RIG-I）是最近几年才发现的一种细胞内的模式识别受体，是机体先天性免疫的重要组成部分。在病毒感染机体、在细胞内复制增殖时，RIG-I能特异性地识别并结合这一过程中所产生的RNA，改变自身构象，与下游接头分子结合，开启信号通路，最终使机体发挥先天性免疫作用。RIG-I在进化中是保守的，鸡基因组内没有RIG-I基因，鸭和鹅则具有完整的RIG-I基因。新城疫和禽流感每次爆发都造成鸡的大面积感染，RIG-I可以识别并结合这两种病毒在细胞内复制时产生的RNA，这两者中是否存在联系，引起了很多研究人员的兴趣。本试验利用PiggyBac转座子系统，构建稳定表达鹅源RIG-I基因的鸡胚成纤维细胞（DF-1）系，为后续的试验研究奠定基础。本试验主要内容和结果如下：1.稳定表达鹅源RIG-I的鸡胚成纤维细胞的构建根据GenBank上的RIG-I序列，结合PiggyBac-513B-1载体序列设计出引物，以质粒Flag-RIG-I为模板进行PCR扩增，经酶切后将RIG-I与载体PiggyBac-513B-1相连，转染入细胞后...
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文章综述
1.1 RIG-I 简介
1.1.1 RIG-I 概述
1.1.2 RIG-I 的结构
1.2 RIG-I 介导的信号通路
1.3 禽 RIG-I 样受体研究进展
1.3.1 禽 RIG-I 研究进展
1.3.2 禽 MDA5 概述
1.3.3 禽 LGP-2 概述
1.4 PiggyBac 简介
1.4.1 转座子概述
1.4.2 PiggyBac 转座子概述
1.5 本研究的目的与意义
第二章 研究内容
2.1 材料
2.1.1 实验动物、所用载体和细胞株
2.1.2 试剂
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 实验中所用溶液的配制
2.2 方法
2.2.1 常用试验技术及试剂盒的使用方法
2.2.2 引物的设计
2.2.3 鹅源 RIG-I 基因全长及 CARD 区域的 PCR 扩增
2.2.4 原核表达载体 pET-32a-CARD 的构建及鉴定
2.2.5 PiggyBac-RIG-I 载体的构建及鉴定
2.2.6 鹅源 RIG-I CARD 区域多克隆抗血清的制备
2.2.7 RT-PCR 鉴定引物的特异性验证
2.2.8 鸡胚成纤维细胞的制备
2.2.9 DF-1 细胞对嘌呤霉素的敏感性实验
2.2.10 构建稳定表达鹅源 RIG-I 的鸡胚成纤维细胞系
2.2.11 细胞系稳定传代的鉴定
2.3 结果
2.3.1 鹅源 RIG-I 全基因的 PCR 扩增
2.3.2 鹅源 RIG-I 基因 CARD 区域的 PCR 扩增
2.3.3 pET-32A-CARD 载体的 PCR 鉴定
2.3.4 PiggyBac-513B-1-RIG-I 载体的 PCR 鉴定
2.3.5 鹅源 RIG-I CARD 区域多克隆抗血清的制备
2.3.6 RT-PCR 鉴定引物特异性验证
2.3.7 DF-1 细胞对嘌呤霉素的敏感性实验
2.3.8 转染用质粒浓度测定
2.3.9 细胞系鉴定
2.4 讨论
结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]病毒感染引发天然免疫细胞信号转导研究进展[J]. 孙文香,蒋争凡. 中国细胞生物学学报. 2013(05)
[2]Generation of a human embryonic stem cell line stably expressing high levels of the fluorescent protein mCherry[J]. Dmitry A Ovchinnikov,Jennifer P Turner,Drew M Titmarsh,Nilay Y Thakar,Dong Choon Sin,Justin J Cooper-White,Ernst J Wolvetang. World Journal of Stem Cells. 2012(07)
[3]利用piggyBac载体制备小鼠诱导性多能干细胞[J]. 张金吨,赵丽霞,吴宝江,李云霞,张静南,苏杰,孙伟,戴雁峰,郭继彤,胡树香,李瑶,汪玮,刘鹏涛,李喜和. 中国科学:生命科学. 2012(07)
[4]二化螟piggyBac类转座子的克隆与分析[J]. 罗光华,吴敏,韩召军,李晓欢,钱路,方继朝. 昆虫学报. 2012(07)
[5]抗病毒感染固有免疫应答的信号转导[J]. 谢广成,段招军. 病毒学报. 2012(03)
[6]鹅模式受体MDA5基因克隆及功能分析[J]. 丁娜,孙英杰,张石磊,仇旭升,谭磊,丁铲. 中国动物传染病学报. 2012(03)
[7]禽Toll样受体研究进展[J]. 丁娜,孙英杰,丁铲. 中国动物传染病学报. 2011(06)
[8]反向PCR鉴定piggyBac介导的哺乳动物细胞转基因研究[J]. 郝碧芳,王猛. 河南农业科学. 2011(10)
[9]转座子在动物转基因研究中的应用[J]. 谢维欣,武建明,王洪梅,高运东,仲跻峰,何洪彬. 家畜生态学报. 2011(05)
[10]视黄酸诱导基因-Ⅰ样受体与抗病毒固有免疫的研究进展[J]. 陈思源,杨毅,王卫平. 中国免疫学杂志. 2011(07)
硕士论文
[1]细胞PKR-eIF2α抗新城疫病毒作用研究[D]. 张石磊.中国农业科学院 2013
[2]稳定表达新城疫病毒V蛋白DF-1细胞系的建立[D]. 唐文雅.西北农林科技大学 2012
本文编号：3133666
【文章来源】：吉林农业大学吉林省
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文章综述
1.1 RIG-I 简介
1.1.1 RIG-I 概述
1.1.2 RIG-I 的结构
1.2 RIG-I 介导的信号通路
1.3 禽 RIG-I 样受体研究进展
1.3.1 禽 RIG-I 研究进展
1.3.2 禽 MDA5 概述
1.3.3 禽 LGP-2 概述
1.4 PiggyBac 简介
1.4.1 转座子概述
1.4.2 PiggyBac 转座子概述
1.5 本研究的目的与意义
第二章 研究内容
2.1 材料
2.1.1 实验动物、所用载体和细胞株
2.1.2 试剂
2.1.3 主要仪器设备
2.1.4 实验中所用溶液的配制
2.2 方法
2.2.1 常用试验技术及试剂盒的使用方法
2.2.2 引物的设计
2.2.3 鹅源 RIG-I 基因全长及 CARD 区域的 PCR 扩增
2.2.4 原核表达载体 pET-32a-CARD 的构建及鉴定
2.2.5 PiggyBac-RIG-I 载体的构建及鉴定
2.2.6 鹅源 RIG-I CARD 区域多克隆抗血清的制备
2.2.7 RT-PCR 鉴定引物的特异性验证
2.2.8 鸡胚成纤维细胞的制备
2.2.9 DF-1 细胞对嘌呤霉素的敏感性实验
2.2.10 构建稳定表达鹅源 RIG-I 的鸡胚成纤维细胞系
2.2.11 细胞系稳定传代的鉴定
2.3 结果
2.3.1 鹅源 RIG-I 全基因的 PCR 扩增
2.3.2 鹅源 RIG-I 基因 CARD 区域的 PCR 扩增
2.3.3 pET-32A-CARD 载体的 PCR 鉴定
2.3.4 PiggyBac-513B-1-RIG-I 载体的 PCR 鉴定
2.3.5 鹅源 RIG-I CARD 区域多克隆抗血清的制备
2.3.6 RT-PCR 鉴定引物特异性验证
2.3.7 DF-1 细胞对嘌呤霉素的敏感性实验
2.3.8 转染用质粒浓度测定
2.3.9 细胞系鉴定
2.4 讨论
结论
参考文献
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]病毒感染引发天然免疫细胞信号转导研究进展[J]. 孙文香,蒋争凡. 中国细胞生物学学报. 2013(05)
[2]Generation of a human embryonic stem cell line stably expressing high levels of the fluorescent protein mCherry[J]. Dmitry A Ovchinnikov,Jennifer P Turner,Drew M Titmarsh,Nilay Y Thakar,Dong Choon Sin,Justin J Cooper-White,Ernst J Wolvetang. World Journal of Stem Cells. 2012(07)
[3]利用piggyBac载体制备小鼠诱导性多能干细胞[J]. 张金吨,赵丽霞,吴宝江,李云霞,张静南,苏杰,孙伟,戴雁峰,郭继彤,胡树香,李瑶,汪玮,刘鹏涛,李喜和. 中国科学:生命科学. 2012(07)
[4]二化螟piggyBac类转座子的克隆与分析[J]. 罗光华,吴敏,韩召军,李晓欢,钱路,方继朝. 昆虫学报. 2012(07)
[5]抗病毒感染固有免疫应答的信号转导[J]. 谢广成,段招军. 病毒学报. 2012(03)
[6]鹅模式受体MDA5基因克隆及功能分析[J]. 丁娜,孙英杰,张石磊,仇旭升,谭磊,丁铲. 中国动物传染病学报. 2012(03)
[7]禽Toll样受体研究进展[J]. 丁娜,孙英杰,丁铲. 中国动物传染病学报. 2011(06)
[8]反向PCR鉴定piggyBac介导的哺乳动物细胞转基因研究[J]. 郝碧芳,王猛. 河南农业科学. 2011(10)
[9]转座子在动物转基因研究中的应用[J]. 谢维欣,武建明,王洪梅,高运东,仲跻峰,何洪彬. 家畜生态学报. 2011(05)
[10]视黄酸诱导基因-Ⅰ样受体与抗病毒固有免疫的研究进展[J]. 陈思源,杨毅,王卫平. 中国免疫学杂志. 2011(07)
硕士论文
[1]细胞PKR-eIF2α抗新城疫病毒作用研究[D]. 张石磊.中国农业科学院 2013
[2]稳定表达新城疫病毒V蛋白DF-1细胞系的建立[D]. 唐文雅.西北农林科技大学 2012
本文编号：3133666
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