番鸭精原干细胞的分离鉴定与培养体系的优化

发布时间：2021-04-13 02:41

　　本研究以番鸭为研究对象,通过对番鸭精原干细胞（SSCs）的分离培养、鉴定以及体外培养体系的筛选,以期为将来进行番鸭SSCs的长期培养与遗传操作提供基础资料。1.以28-30胚龄番鸭为试验材料,通过两步酶消化法结合差速贴壁法分离纯化睾丸单细胞悬液,通过形态学鉴定、AKP染色以及特异表达基因的检测证明分离出的单细胞悬液中存在SSCs。2.分别采用不同的饲养层及不同血清浓度体外培养SSCs,观察其增殖水平及克隆生成率。SSCs在均含10%FBS的明胶包被的无饲养层、成纤维细胞（DEF）饲养层、支持细胞（Sertoli细胞）饲养层的培养体系中培养6d的增殖率平均为106.62%、125.14%、126.87%,细胞克隆率平均为3.30%、27.80%、29.85%;在使用Sertoli细胞饲养层并分别加入0%、5%、10%、15%FBS的培养体系中培养6d的增殖率平均为26.29%、123.81%、126.73%、119.12%,细胞克隆率平均为0、30.78%、28.08%、25.08%。不同饲养层培养体系及血清含量不同的培养体系显著优于对照组（P<0.01）。培养于饲养层上,添加适当... 

【文章来源】：福建农林大学福建省

【文章页数】：45 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１体外培养传至第二代的ＤＥＦ?（４００Ｘ）??

图２接种番鸭ＳＳＣｓ的Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞词养层（２００?Ｘ?）??Ｆｉｇ．２?Ｓｅｒｔｏｌｉ?ｃｅｌｌｓ?ｆｅｅｄｅｒ?ｌａｙｅｒｓ?ｓｅｅｄｉｎｇ?ｏｆ?ＳＳＣｓ?（２００?ＸＳＳＣｓ体外培养效果的影响??表３不同饲养层对番鸭ＳＳＣｓ体外培养效果的比?Ｔｈｅ?ｒａｔｅ?ｏｆ?ＳＳＣｓ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ＳＳＣｓ?ｃｏｌｏｎｙ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅ对照组?ＤＥＦ词养层?ＳｅＣｏｎｔｒｏｌ?ＤＥＦ?ｆｅｅｄｅｒ?ｌａｙｅｒ?Ｓｅ１０６．６２±３．２１Ａ?１２５．１４±１．６６Ｂ，?Ａ?，?Ｂ３．３０?士?０．９３ａ?２７．８０±３．１８ｂ母表示有无显著性差异。不同大写字母为极显著（Ｐ＜０．０１），表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）。下表同。??ａｒｋｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓａｍｅ?ｒｏｗ?ｓｈｏｗ?ｗｉｔｈ?ｏｒ?ｗｉｔｈｏｕｔ?ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ．?Ｔｈ

表明ＳＳＣｓ已经开始退化。在培养至６ｄ时ＳＳＣｓ细胞增殖率为１０６．６２％，细胞克隆率为３．３０％。??接种于ＤＥＦ饲养层上的ＳＳＣｓ在培养至４ｄ时开始形成葡萄串状或是巢状的克隆团族，??细胞数明显多于无饲养层组（如图４）。此时ＳＳＣｓ增值旺盛但贴壁不牢。培养至６ｄ时，饲??养层细胞贴壁不牢，开始老化；部分ＳＳＣｓ有开始分化的迹象，细胞内形成空泡（如图５），??随即将ＳＳＣｓ传代，然后接种于新的饲养层。此时ＳＳＣｓ细胞增殖率为１２５．１４％，细胞克隆??率为２７．８０％。传代后２－３ｄ，大部分ＳＳＣｓ呈集落状生长，细胞边缘不明显，细胞数逐步下??降后趋于稳定。细胞传至第三代后细胞克隆能力下降，开始分化、解离，随换液丢失严重。??■丨■??图４、５?ＤＦＥ词养层组培养４ｄ和６ｄ的ＳＳＣｓ集落（４００Ｘ?）??Ｆｉｇ．４、５?ＳＳＣｓ?ｃｏｌｏｎｙ?ｆｏｒｍｅｄ?ｏｎ?ＤＥＦ?ｆｅｅｄｅｒ?ｌａｙｅｒｓ?ｃｕｌｔｕｒｅｄ?４ｄ?ａｎｄ?６ｄ?ｌａｔｅｒ?（４００?Ｘ）??接种于Ｓｅｒｔｏｌｉ细胞饲养层上培养４ｄ的ＳＳＣｓ在形态、贴壁时间和生长情况等方面与ＤＥＦ??饲养层组均无明显差异（如图６）。在培养至６ｄ，?ＳＳＣｓ细胞增殖率为１２６．８７％，细胞克隆率??为?２９．８５％?（如图?７）。??２２??

【参考文献】：
期刊论文
[1]果蝇精子发生相关基因及其功能调控[J]. 赵晓俊,李雅娟,顾蔚.  生理科学进展. 2013(02)
[2]维生素A对体外培养小鼠精原干细胞生长增殖的影响[J]. 胡建新,孙兆林,何坚,梁韶峰,张勇,谭宗建,袁军.  中国组织工程研究与临床康复. 2010(10)
[3]家畜精原干细胞移植研究进展[J]. 贾映辉,金梅,刘鹏,敖红.  安徽农业科学. 2009(03)
[4]人成纤维细胞饲养层的制备及其对胚胎干细胞生长支持作用[J]. 米蔷,何志旭,段茂利,王志华,杨燕.  复旦学报(医学版). 2008(05)
[5]小鼠精原干细胞体外培养的研究[J]. 柴玮杰,王玉燕,高珉之,王瑞翀,赵博.  医学动物防制. 2008(08)
[6]达兰猪精原干细胞的分离、纯化和初步鉴定[J]. 薛振华,刘国世,史建民,王梁,田秀芝,王永彬,侯保民,田见晖,曾申明,朱士恩.  中国农业大学学报. 2008(02)
[7]KnockoutTM SR无血清培养基支持小鼠精原干细胞的短期存活（简报）[J]. 王庆忠,韩春生.  分子细胞生物学报. 2008(02)
[8]同源物种不同饲养层对鸡精原干细胞体外培养的影响[J]. 魏彩霞,孙国波,余飞,李碧春.  中国家禽. 2007(12)
[9]睾丸提取液、EGF、雌激素对小鼠精原干细胞体外存活和增殖的效果[J]. 张学明,李德雪,岳占碰,于家傲,张世庆,李恩中,李政.  中国农学通报. 2006(06)
[10]人精原干细胞特异性标志的初步筛选[J]. 李彦锋,郭应禄,李晓红,靳凤烁,孙中义,张克勤.  中华男科学杂志. 2005(07)

博士论文
[1]精原干细胞自增殖分子机制研究[D]. 张世庆.中国人民解放军军事医学科学院 2007
[2]小鼠精原干细胞培养体系的优化及体外基因转移[D]. 张学明.吉林大学 2005

硕士论文
[1]猪精原干细胞的分离培养及鉴定[D]. 寇小琴.中国农业科学院 2012
[2]精原干细胞的有效分离及体外扩增方法的研究[D]. 冉竞超.西北农林科技大学 2012
[3]小鼠精原干细胞的分离培养及诱导分化[D]. 宋锐.安徽农业大学 2010
[4]鸡精原干细胞体外培养及不同细胞因子的影响[D]. 孙思宇.扬州大学 2006



本文编号：3134462