解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens K11高效表达体系的建立及其高效表达元件的优化
发布时间：2021-04-14 05:14
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是多种重要饲用酶制剂的生产菌株,因其具有较强的蛋白分泌能力,其在作为高效表达宿主菌方面具有巨大的发展潜力及应用前景。然而,解淀粉芽孢杆菌中存在的限制修饰系统、质粒稳定性差、表达元件缺乏以及内源蛋白酶活力高等问题严重限制了其在基因工程研究中的广泛应用。本研究的核心材料解淀粉芽孢杆菌K11（B.amyloliquefaciens K11）是一株高产中性蛋白酶和角蛋白酶的菌株。前期通过转化条件的摸索和质粒结构元件的优化,已较好的解决了 K11菌株遗传和质粒稳定性差的难题,为将K11菌株开发成为高效的异源蛋白表达宿主奠定了坚实的基础。本研究以解淀粉芽孢杆菌K1 1为宿主菌、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BcaprE作为报告基因,通过高产酶蛋白的工业菌株的强启动子（PamyQ、PaprE、Pnpr）和高效分泌信号肽（SPamyQ、SPaprE、SPnpr）的优化组合,筛选适用于K11菌株高效分泌表达外源蛋白的通用表达元件。摇瓶测试结果显示:在以α-淀粉酶基因启动子PamyQ、碱性蛋白酶基因信号肽SPaprE组成的表达元件调控下,...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：94 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
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ＱＱ－Ｅ，?ＮＮ－Ｅ，?ＣＱ－Ｅ，?ＣＮ－Ｅ，ＱＣ－Ｅ，ＱＮ－Ｅ，ＮＣ－Ｅ?和?ＮＱ－Ｅ。??将这９株重组菌在同一发酵条件下进行摇瓶发酵，７２?ｈ后测定上清液中的碱性蛋??白酶活性。从图２．４ａ可以看出，９个表达元件均能介导碱性蛋白酶基因在解??淀粉芽孢杆菌Ｋ１１中的重组表达，重组表达水平分别是对照菌株Ｋ１１－Ｃ的１．１７－１６．６３??倍。其中，由尸ａｍｊ；２－ＳＰａｐｒＥ介导的ＱＣ－Ｅ菌株的碱性蛋白酶的分泌水平最高，为１３８０４??Ｕ／ｍＬ；?Ｐｆｌ严五－ＳＰａｍｙＱ介导的的菌株ＣＱ－Ｅ的产酶水平次之，为１１０９１?Ｕ／ｍＬ。菌株??ＱＣ－Ｅ和ＣＱ－Ｅ所分泌的胞外ＢｃａｐｒＥ的水平远远高于其他表达元件所介导的产酶水平??（９７３－６１１９?Ｕ／ｍＬ）。??ａ?ｂ??２?ＩＳＯＷ?ｋＤａ?Ｍ?Ｉ?２?３?４?５?６?７?８?９?ｉ〇??ｆ?ｎｏｆｉｏ?－?ｌ０？??ｉ６０００?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ??ｊ?Ｉ?Ｌｉｌｉｉｌ－?，５广??，＂纖（卿ｌ°“卜?，??图２．４不同表达元件介导的重组碱性蛋白酶ＳｃａｐｒＥ摇瓶发酵产酶情况??Ｆｉｇ?２．４?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ａｌｋａｌｉｎｅ?ｐｒｏｔｅａｓｅ?ＢｃａｐｖＥ?ｉｎ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?Ｂ．?ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ??ｓｔｒａｉｎｓ?ｏｎ?ｓｈａｋｅ?ｆｌａｓｋ?ｌｅｖｅｌ??将９株重组菌和对照菌株ＩＣｌｌ－Ｃ的发酵上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析。据??Ｖｅｃｔｏｒ软件分析，碱性蛋白酶ＢｃａｐｒＥ成熟蛋白的大小应为２６．８?ｋＤａ。从图２．４ｂ可以??看出
进行摇瓶发酵，７２?ｈ后分别测定发酵上清液液中的生麦芽糖淀粉酶活性或中性蛋白酶??活性。??从图２．５可以看出，发酵７２?ｈ后，重组菌ＱＣ－Ｍ发酵上清液中的生麦芽糖淀粉??酶活力可达１９?Ｕ／ｍＬ，而对照菌株Ｋ１１－Ｃ中则未检测到任何的生麦芽糖淀粉酶活性，??说明生麦芽糖淀粉酶基因Ｇｓ－Ｍ／ｌｃｗｅ在Ｐａｍ＿ｙ０－ＳＰａｐｒＥ表达兀件的介导下，成功实现??了在解淀粉芽孢杆菌Ｋ１１中的分泌表达。??８?２？．?ｂ?ｋＤａ?Ｍ??卜．?Ｉ?Ｍｌ??■如．二二，??■??７?〇?——?一＾—＇?＿?ｄ，??ＫＩｌ－Ｃ?ＱＣ－Ｍ??图２．５重组生麦芽糖淀粉酶在解淀粉芽孢杆菌ＩＣ１１中的产酶情况??Ｆｉｇ．?２．５?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ?ａ－ａｍｙｌａｓｅ?Ｇ＾－ＭＡａｓｅ?ｉｎ?Ｂ．?ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ?Ｋ１１??ｏｎ?ｓｈａｋｅ?ｆｌａｓｋ?ｌｅｖｅｌ．??３９??
【参考文献】：
期刊论文
[1]紫外线等离子体复合诱变解淀粉芽孢杆菌提高NAG产量[J]. 黎恒,张琳,陈红爽,张孟阳,黄娟,张岚,王德培. 食品研究与开发. 2018(12)
[2]高产3-羟基丁酮解淀粉芽孢杆菌的选育及发酵优化[J]. 王诗卉,罗秋玲,刘佳,刘立明,陈修来. 生物工程学报. 2018(05)
[3]一种高效表达碱性蛋白酶的新型启动子的筛选及研究[J]. 陈坤,袁飞燕,柴昊男,刘焕,王兴吉,张会图,路福平. 生物技术通报. 2018(01)
[4]解淀粉芽孢杆菌HZ-1510壳聚糖酶基因的克隆、重组表达及其活性[J]. 段静,刘广鑫,董晏君,周洋,李锦铨,刘小玲,周萌,梁日深,赵丽娟,林蠡. 水产学报. 2017(10)
[5]一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其酶促反应适宜条件初步研究[J]. 刘宇,李阳,尹珺伊,侯美茹,王岩,秦平伟,史同瑞,朱战波. 家畜生态学报. 2017(04)
[6]解淀粉芽孢杆菌诱变育种及其突变株在降低酱油中氨基甲酸乙酯的应用[J]. 张梦寒,李巧玉,周朝晖,卢丽玲,堵国成,陈坚,方芳. 微生物学报. 2017(12)
[7]解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵优化[J]. 王楠,苑畅,汪瑞,淳于彦洁,吴雅雯,李金宝,丁重阳. 生物加工过程. 2016(06)
[8]解淀粉芽孢杆菌在畜禽养殖中的应用研究进展[J]. 栾素军,邢焕,孙永波,萨仁娜,张宏福. 中国畜牧兽医. 2016(10)
[9]通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达[J]. 葛春蕾,刘中美,崔文璟,周丽,郭军玲,胡云峰,周哲敏. 现代食品科技. 2016(11)
[10]一种芽孢杆菌中性蛋白酶启动子的克隆和验证[J]. 纪明华,赵利超,史吉平,孙俊松. 食品工业科技. 2016(13)
博士论文
[1]基于全基因组测序和系统生物学分析的鸟苷工业生产菌分子育种研究[D]. 杨慧林.华南理工大学 2012
[2]中温α-淀粉酶编码基因剂量对其生产水平提升的重要作用[D]. 刘洋.江南大学 2009
本文编号：3136733
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：94 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
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ＱＱ－Ｅ，?ＮＮ－Ｅ，?ＣＱ－Ｅ，?ＣＮ－Ｅ，ＱＣ－Ｅ，ＱＮ－Ｅ，ＮＣ－Ｅ?和?ＮＱ－Ｅ。??将这９株重组菌在同一发酵条件下进行摇瓶发酵，７２?ｈ后测定上清液中的碱性蛋??白酶活性。从图２．４ａ可以看出，９个表达元件均能介导碱性蛋白酶基因在解??淀粉芽孢杆菌Ｋ１１中的重组表达，重组表达水平分别是对照菌株Ｋ１１－Ｃ的１．１７－１６．６３??倍。其中，由尸ａｍｊ；２－ＳＰａｐｒＥ介导的ＱＣ－Ｅ菌株的碱性蛋白酶的分泌水平最高，为１３８０４??Ｕ／ｍＬ；?Ｐｆｌ严五－ＳＰａｍｙＱ介导的的菌株ＣＱ－Ｅ的产酶水平次之，为１１０９１?Ｕ／ｍＬ。菌株??ＱＣ－Ｅ和ＣＱ－Ｅ所分泌的胞外ＢｃａｐｒＥ的水平远远高于其他表达元件所介导的产酶水平??（９７３－６１１９?Ｕ／ｍＬ）。??ａ?ｂ??２?ＩＳＯＷ?ｋＤａ?Ｍ?Ｉ?２?３?４?５?６?７?８?９?ｉ〇??ｆ?ｎｏｆｉｏ?－?ｌ０？??ｉ６０００?Ｉ?Ｉ?Ｉ?Ｉ??ｊ?Ｉ?Ｌｉｌｉｉｌ－?，５广??，＂纖（卿ｌ°“卜?，??图２．４不同表达元件介导的重组碱性蛋白酶ＳｃａｐｒＥ摇瓶发酵产酶情况??Ｆｉｇ?２．４?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ａｌｋａｌｉｎｅ?ｐｒｏｔｅａｓｅ?ＢｃａｐｖＥ?ｉｎ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?Ｂ．?ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ??ｓｔｒａｉｎｓ?ｏｎ?ｓｈａｋｅ?ｆｌａｓｋ?ｌｅｖｅｌ??将９株重组菌和对照菌株ＩＣｌｌ－Ｃ的发酵上清液进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分析。据??Ｖｅｃｔｏｒ软件分析，碱性蛋白酶ＢｃａｐｒＥ成熟蛋白的大小应为２６．８?ｋＤａ。从图２．４ｂ可以??看出
进行摇瓶发酵，７２?ｈ后分别测定发酵上清液液中的生麦芽糖淀粉酶活性或中性蛋白酶??活性。??从图２．５可以看出，发酵７２?ｈ后，重组菌ＱＣ－Ｍ发酵上清液中的生麦芽糖淀粉??酶活力可达１９?Ｕ／ｍＬ，而对照菌株Ｋ１１－Ｃ中则未检测到任何的生麦芽糖淀粉酶活性，??说明生麦芽糖淀粉酶基因Ｇｓ－Ｍ／ｌｃｗｅ在Ｐａｍ＿ｙ０－ＳＰａｐｒＥ表达兀件的介导下，成功实现??了在解淀粉芽孢杆菌Ｋ１１中的分泌表达。??８?２？．?ｂ?ｋＤａ?Ｍ??卜．?Ｉ?Ｍｌ??■如．二二，??■??７?〇?——?一＾—＇?＿?ｄ，??ＫＩｌ－Ｃ?ＱＣ－Ｍ??图２．５重组生麦芽糖淀粉酶在解淀粉芽孢杆菌ＩＣ１１中的产酶情况??Ｆｉｇ．?２．５?Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ?ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ?ａ－ａｍｙｌａｓｅ?Ｇ＾－ＭＡａｓｅ?ｉｎ?Ｂ．?ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ?Ｋ１１??ｏｎ?ｓｈａｋｅ?ｆｌａｓｋ?ｌｅｖｅｌ．??３９??
【参考文献】：
期刊论文
[1]紫外线等离子体复合诱变解淀粉芽孢杆菌提高NAG产量[J]. 黎恒,张琳,陈红爽,张孟阳,黄娟,张岚,王德培. 食品研究与开发. 2018(12)
[2]高产3-羟基丁酮解淀粉芽孢杆菌的选育及发酵优化[J]. 王诗卉,罗秋玲,刘佳,刘立明,陈修来. 生物工程学报. 2018(05)
[3]一种高效表达碱性蛋白酶的新型启动子的筛选及研究[J]. 陈坤,袁飞燕,柴昊男,刘焕,王兴吉,张会图,路福平. 生物技术通报. 2018(01)
[4]解淀粉芽孢杆菌HZ-1510壳聚糖酶基因的克隆、重组表达及其活性[J]. 段静,刘广鑫,董晏君,周洋,李锦铨,刘小玲,周萌,梁日深,赵丽娟,林蠡. 水产学报. 2017(10)
[5]一株产纤维素酶的解淀粉芽孢杆菌的分离鉴定及其酶促反应适宜条件初步研究[J]. 刘宇,李阳,尹珺伊,侯美茹,王岩,秦平伟,史同瑞,朱战波. 家畜生态学报. 2017(04)
[6]解淀粉芽孢杆菌诱变育种及其突变株在降低酱油中氨基甲酸乙酯的应用[J]. 张梦寒,李巧玉,周朝晖,卢丽玲,堵国成,陈坚,方芳. 微生物学报. 2017(12)
[7]解淀粉芽孢杆菌产凝乳酶发酵优化[J]. 王楠,苑畅,汪瑞,淳于彦洁,吴雅雯,李金宝,丁重阳. 生物加工过程. 2016(06)
[8]解淀粉芽孢杆菌在畜禽养殖中的应用研究进展[J]. 栾素军,邢焕,孙永波,萨仁娜,张宏福. 中国畜牧兽医. 2016(10)
[9]通过串联启动子实现纳豆激酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达[J]. 葛春蕾,刘中美,崔文璟,周丽,郭军玲,胡云峰,周哲敏. 现代食品科技. 2016(11)
[10]一种芽孢杆菌中性蛋白酶启动子的克隆和验证[J]. 纪明华,赵利超,史吉平,孙俊松. 食品工业科技. 2016(13)
博士论文
[1]基于全基因组测序和系统生物学分析的鸟苷工业生产菌分子育种研究[D]. 杨慧林.华南理工大学 2012
[2]中温α-淀粉酶编码基因剂量对其生产水平提升的重要作用[D]. 刘洋.江南大学 2009
本文编号：3136733
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