Leachii支原体粘附蛋白的筛选及单克隆抗体的制备

发布时间：2021-04-14 22:28

　　leachii支原体可直接引起犊牛多发性关节炎和母牛乳房炎,与犊牛肺炎有关,属于支原体科（Mycoplasmataceae）、支原体属（Mycoplasma）、丝状支原体族（Mycoplasma mycoides）成员之一。其引起的犊牛多发性关节炎的致死率不高,但是对关节造成的不可逆性损伤,导致发病犊牛100%淘汰,对养牛业具有较大威胁。我国于2009年在患关节炎犊牛的关节液内分离获得leachii支原体。目前,国内外对leachii支原体的研究主要集中于病原的分离鉴定、遗传进化分类以及致病性等方面,而对该病原的致病机理、传播途径以及防控措施的研究还鲜有报道。已有研究表明,支原体对宿主细胞的直接粘附是其感染的第一步,是研究支原体致病机制的重要方面,因此对leachii支原体粘附蛋白的筛选及鉴定有助于阐明其致病机制。本研究采用序列分析、同源性比对、蛋白表达及细胞粘附与粘附抑制试验等方法,筛选并鉴定leachii支原体的粘附蛋白。通过对leachii支原体全基因组序列的分析,并与其他支原体已鉴定的粘附蛋白进行同源性比对,假定lppA基因和eno基因编码的LPPA蛋白和a-烯醇酶为leach... 

【文章来源】：东北农业大学黑龙江省 211工程院校

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 支原体概述
        1.1.1 支原体的概念及特征
        1.1.2 支原体的分类
        1.1.3 支原体的分离鉴定
        1.1.4 支原体病的诊断
        1.1.5 支原体的致病机制
    1.2 支原体及其粘附蛋白的研究进展
        1.2.1 人肺炎支原体（M.pneumonia,Mp）
        1.2.2 人生殖支原体（M.genitalium,Mg）
        1.2.3 猪肺炎支原体（M.opneumoniae,Mhp）
        1.2.4 牛支原体（M.bovis）
        1.2.5 丝状支原体丝状亚种SC小菌落型（M.mycoides subsp.Mycoides SC, MmmSC）
        1.2.6 山羊传染性胸膜肺炎相关支原体
    1.3 leachii支原体概述
        1.3.1 发现与研究历史
        1.3.2 致病性
        1.3.3 传播途径
        1.3.4 诊断
        1.3.5 防控
    1.4 研究的目的及意义
        1.4.1 leachii支原体粘附蛋白的筛选
        1.4.2 leachii支原体单克隆抗体的制备
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 菌株、载体、细胞及实验动物
        2.1.2 主要试剂及试剂盒
        2.1.3 主要仪器设备
        2.1.4 主要试剂及配置方法
    2.2 方法
        2.2.1 leachii支原体的培养
        2.2.2 leachii支原体基因组的提取
        2.2.3 lppA基因及eno基因的PCR扩增
        2.2.4 eno基因的定点诱变
        2.2.5 重组蛋白的表达与纯化
        2.2.6 重组蛋白多克隆抗体的制备
        2.2.7 Western b1ot
        2.2.8 LPPA蛋白及a-烯醇酶的膜定位
        2.2.9 细胞粘附抑制试验
        2.2.11 重组蛋白特异性粘附试验
        2.2.12 leachii支原体全菌体免疫原的制备
        2.2.13 动物的免疫接种
        2.2.14 杂交瘤细胞株的建立
        2.2.15 杂交瘤细胞的筛选
        2.2.16 腹水的制备
3 结果
    3.1 leachii支原体粘附蛋白的筛选与鉴定
        3.1.1 lppA和eno基因的获得
        3.1.2 pET28a-lppA及pET28a-eno重组质粒的构建
        3.1.3 重组质粒pET28a-lppA和pET28a-eno的诱导表达
        3.1.4 重组LPPA蛋白和a-烯醇酶的纯化
        3.1.5 LPPA及a-烯醇酶的膜定位
        3.1.6 LPPA及a-烯醇酶的粘附特性
    3.2 leachii支原体单克隆抗体的制备
        3.2.1 leachii支原体单克隆抗体的反应性
        3.2.2 leachii支原体单克隆抗体的效价
        3.2.3 leachii支原体单克隆抗体的亚类鉴定
        3.2.4 leachii支原体单克隆抗体的粘附抑制特性
4 全文结论
    4.1 leachii支原体粘附蛋白的筛选
    4.2 leachii支原体单克隆抗体的制备
5 讨论
    5.1 LPPA蛋白与a-烯醇酶在leachii支原体粘附过程中的作用
    5.2 粘附蛋白与leachii支原体毒力的相关性
    5.3 粘附蛋白作为疫苗候选抗原的免疫保护性
    5.4 用单克隆抗体鉴定leachii支原体的粘附蛋白
    5.5 单克隆抗体在leachii支原体病诊断中的应用
致谢
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]山羊传染性胸膜肺炎的综合防治[J]. 聂庆华,刘博宇,蔡亚南,张媛,赵权.  吉林畜牧兽医. 2013(12)
[2]山羊传染性胸膜肺炎双价灭活疫苗的制备及应用效果[J]. 文正常,王璇,潘淑惠,杨粤黔.  贵州农业科学. 2013(06)
[3]牛支原体病诊断方法的研究进展[J]. 蒋勇,周蓓,黎晓敏.  饲料博览. 2013(04)
[4]黏膜抗体在疫苗免疫效力评价中的前景[J]. 张亚,冯志新,张道华,刘茂军,白方方,王海燕,邵国青.  生物技术通报. 2012(02)
[5]家畜重要支原体病疫苗的研究进展[J]. 张轩,储岳峰,逯忠新.  中国兽医科学. 2011(12)
[6]口蹄疫O型固相竞争ELISA抗体检测试剂盒的临床应用[J]. 柴静,林密,周广青,冯霞,马军武.  中兽医医药杂志. 2011(06)
[7]肺炎支原体P1蛋白的研究进展[J]. 赵梦楠,刘宗昂,王舰.  微生物学杂志. 2011(06)
[8]牛传染性胸膜肺炎研究进展[J]. 沈青春,韩明远,王芳,宁宜宝.  中国奶牛. 2010(08)
[9]我国发生Leachii支原体引起的犊牛多发性关节炎[J]. 刘海军,常继涛,于力.  中国预防兽医学报. 2010(06)
[10]生殖支原体致病机制研究现状[J]. 刘红芳,钟山.  皮肤性病诊疗学杂志. 2010(02)

硕士论文
[1]牛支原体粘附相关因子-α-烯醇化酶的研究[D]. 宋志强.中国农业科学院 2012



本文编号：3138127