牛冠状病毒单链抗体的筛选与鉴定
发布时间：2021-04-15 17:45
牛冠状病毒病是世界范围内的重要牛病,其病原牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）可引起犊牛腹泻、成年牛冬痢以及呼吸系统疾病,且常与其他病原混合感染,给全球养牛业的发展造成了巨大的影响。为防止牛冠状病毒病的广泛传播,我们需要在BCoV感染的初期进行诊断并采取相应防制措施。目前,可用来检测牛冠状病毒病原的方法主要有反转录PCR技术和ELISA等,其中ELISA试剂盒主要依赖进口,成本较高且操作不方便,而反转录PCR只适用于少量样品的检测。为建立操作更方便,检测成本更低且更适合大规模检测病原的方法,本研究拟利用BCoV N基因进行表达纯化,并构建BCoV N蛋白噬菌体单链抗体库,以期获得结合活性较高的特异性单链抗体,为BCoV新型快速检测试剂的研发奠定前期基础。本研究内容及结果包括:1.BCoV N蛋白的原核表达及小鼠免疫本试验将已构建好的重组表达载体pET28a-N转入大肠杆菌BL21菌株中,成功表达出目的蛋白,经Western blot鉴定正确后分析蛋白可溶性并进行纯化。结果显示重组蛋白条带大小约54 kDa,为可溶性表达,其可被His单克隆抗体特异性识别,纯化后的...
【文章来源】：河北科技师范学院河北省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
M13噬菌体结构图[65]
第二章BCoVN蛋白的表达与纯化202.3结果2.3.1重组BCoVN蛋白的表达鉴定1.重组N蛋白的表达鉴定将pET28a-N-BL2菌株用1mmol/LIPTG诱导表达8h后，获得重组蛋白，通过SDS-PAGE电泳进行验证（图2-1）。结果显示与pET-28a-BL21对照相比，pET28a-N-BL21在54kDa附近有明显的蛋白表达条带，与预期大小一致。取诱导后的菌液，以1:1000稀释的鼠源抗His标签单克隆抗体为一抗，1:5000稀释的山羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，经由Western-blot鉴定，结果如图2-2，在54kDa处可观察到明显的目的条带，而对照在54kDa处则无条带，表明该重组蛋白可被抗His标签单抗特异性的识别，重组N蛋白能良好的表达。70kDkDM12544055图2-1His-N蛋白的表达分析Fig.2-1AnalysisofprokaryoticexpressionofHis-NproteinM：ProteinMarker;1.空载对照;2.重组蛋白12WB:α-His图2-2Westernblot分析His-N蛋白的表达Fig.2-2WesternblotanalysisofHis-Nproteinexpression1.空载对照;2.重组His-N蛋白
第二章BCoVN蛋白的表达与纯化202.3结果2.3.1重组BCoVN蛋白的表达鉴定1.重组N蛋白的表达鉴定将pET28a-N-BL2菌株用1mmol/LIPTG诱导表达8h后，获得重组蛋白，通过SDS-PAGE电泳进行验证（图2-1）。结果显示与pET-28a-BL21对照相比，pET28a-N-BL21在54kDa附近有明显的蛋白表达条带，与预期大小一致。取诱导后的菌液，以1:1000稀释的鼠源抗His标签单克隆抗体为一抗，1:5000稀释的山羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，经由Western-blot鉴定，结果如图2-2，在54kDa处可观察到明显的目的条带，而对照在54kDa处则无条带，表明该重组蛋白可被抗His标签单抗特异性的识别，重组N蛋白能良好的表达。70kDkDM12544055图2-1His-N蛋白的表达分析Fig.2-1AnalysisofprokaryoticexpressionofHis-NproteinM：ProteinMarker;1.空载对照;2.重组蛋白12WB:α-His图2-2Westernblot分析His-N蛋白的表达Fig.2-2WesternblotanalysisofHis-Nproteinexpression1.空载对照;2.重组His-N蛋白
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗犬细小病毒VP2蛋白单链抗体的制备与中和活性研究[J]. 李彤彤,宋彩玲,杨凯越,王文静,陈慧宇,刘明. 中国生物工程杂志. 2020(04)
[2]噬菌体展示系统筛选糖尿病相关抗原蛋白及应用效果评价[J]. 刘尧,林骏,梁永羿,山云,王洪涛,徐良. 中国医药生物技术. 2019(06)
[3]检测牛冠状病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用[J]. 胡林杰,孟野,周玉龙,贾伟强,翟海瑞,武瑞,侯喜林. 微生物学通报. 2020(01)
[4]噬菌体抗体库技术筛选抗VEGF165单克隆抗体[J]. 詹明硕,刘方杰,张亚兰. 生物技术通讯. 2019(03)
[5]牛冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 何琪富,郭紫晶,李然,周军,岳华,张斌,汤承. 畜牧兽医学报. 2018(10)
[6]鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用[J]. 徐重新,张霄,张存政,刘媛,仲建锋,董飒,胡晓丹,林曼曼,刘贤金. 江苏农业学报. 2017(01)
[7]人源抗EV71病毒中和表位SP70的Fab抗体研制[J]. 余艳琼,翁育伟,严延生. 中国人兽共患病学报. 2016(08)
[8]人源抗H7N9血凝素中和抗体IgG的制备及鉴定[J]. 陈雅,熊四平,唐奇,王怡雯,耿以如,顾慧,徐亚如,周荧,仇镇宁,冯振卿,朱进. 南京医科大学学报(自然科学版). 2016(07)
[9]天山牦牛病毒性腹泻等传染病的血清学监测与调查[J]. 石琴,袁立岗,蒲敬伟,李静,徐晶晶,沙丽,杨晓丹,刘海东. 畜牧与兽医. 2015(06)
[10]BVDV、BCV和BRV三重RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 林初文,沈志强. 畜牧与兽医. 2013(07)
博士论文
[1]人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D]. 李卓.第四军医大学 2017
硕士论文
[1]驼源天然噬菌体纳米抗体展示库的构建和鉴定及抗GDH纳米抗体的筛选[D]. 方媛.宁夏医科大学 2019
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白特异性单域抗体的制备及鉴定[D]. 王莉鑫.内蒙古农业大学 2018
[3]犊牛冠状病毒和轮状病毒间接ELISA诊断方法的建立与初步应用[D]. 陆亚冬.石河子大学 2018
[4]噬菌体天然抗体库淘选及筛选方法的优化[D]. 蒋红欣.上海交通大学 2018
[5]猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达及其特异性单域抗体的制备[D]. 赵鑫鑫.内蒙古农业大学 2017
[6]猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建与筛选[D]. 张秋丽.郑州大学 2017
[7]猪源噬菌体单链抗体库的构建及抗rSpaA单链抗体的筛选[D]. 王锐.湖南农业大学 2016
本文编号：3139801
【文章来源】：河北科技师范学院河北省
【文章页数】：74 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
M13噬菌体结构图[65]
第二章BCoVN蛋白的表达与纯化202.3结果2.3.1重组BCoVN蛋白的表达鉴定1.重组N蛋白的表达鉴定将pET28a-N-BL2菌株用1mmol/LIPTG诱导表达8h后，获得重组蛋白，通过SDS-PAGE电泳进行验证（图2-1）。结果显示与pET-28a-BL21对照相比，pET28a-N-BL21在54kDa附近有明显的蛋白表达条带，与预期大小一致。取诱导后的菌液，以1:1000稀释的鼠源抗His标签单克隆抗体为一抗，1:5000稀释的山羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，经由Western-blot鉴定，结果如图2-2，在54kDa处可观察到明显的目的条带，而对照在54kDa处则无条带，表明该重组蛋白可被抗His标签单抗特异性的识别，重组N蛋白能良好的表达。70kDkDM12544055图2-1His-N蛋白的表达分析Fig.2-1AnalysisofprokaryoticexpressionofHis-NproteinM：ProteinMarker;1.空载对照;2.重组蛋白12WB:α-His图2-2Westernblot分析His-N蛋白的表达Fig.2-2WesternblotanalysisofHis-Nproteinexpression1.空载对照;2.重组His-N蛋白
第二章BCoVN蛋白的表达与纯化202.3结果2.3.1重组BCoVN蛋白的表达鉴定1.重组N蛋白的表达鉴定将pET28a-N-BL2菌株用1mmol/LIPTG诱导表达8h后，获得重组蛋白，通过SDS-PAGE电泳进行验证（图2-1）。结果显示与pET-28a-BL21对照相比，pET28a-N-BL21在54kDa附近有明显的蛋白表达条带，与预期大小一致。取诱导后的菌液，以1:1000稀释的鼠源抗His标签单克隆抗体为一抗，1:5000稀释的山羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，经由Western-blot鉴定，结果如图2-2，在54kDa处可观察到明显的目的条带，而对照在54kDa处则无条带，表明该重组蛋白可被抗His标签单抗特异性的识别，重组N蛋白能良好的表达。70kDkDM12544055图2-1His-N蛋白的表达分析Fig.2-1AnalysisofprokaryoticexpressionofHis-NproteinM：ProteinMarker;1.空载对照;2.重组蛋白12WB:α-His图2-2Westernblot分析His-N蛋白的表达Fig.2-2WesternblotanalysisofHis-Nproteinexpression1.空载对照;2.重组His-N蛋白
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗犬细小病毒VP2蛋白单链抗体的制备与中和活性研究[J]. 李彤彤,宋彩玲,杨凯越,王文静,陈慧宇,刘明. 中国生物工程杂志. 2020(04)
[2]噬菌体展示系统筛选糖尿病相关抗原蛋白及应用效果评价[J]. 刘尧,林骏,梁永羿,山云,王洪涛,徐良. 中国医药生物技术. 2019(06)
[3]检测牛冠状病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用[J]. 胡林杰,孟野,周玉龙,贾伟强,翟海瑞,武瑞,侯喜林. 微生物学通报. 2020(01)
[4]噬菌体抗体库技术筛选抗VEGF165单克隆抗体[J]. 詹明硕,刘方杰,张亚兰. 生物技术通讯. 2019(03)
[5]牛冠状病毒RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 何琪富,郭紫晶,李然,周军,岳华,张斌,汤承. 畜牧兽医学报. 2018(10)
[6]鼠源噬菌体抗体展示库的构建及初步应用[J]. 徐重新,张霄,张存政,刘媛,仲建锋,董飒,胡晓丹,林曼曼,刘贤金. 江苏农业学报. 2017(01)
[7]人源抗EV71病毒中和表位SP70的Fab抗体研制[J]. 余艳琼,翁育伟,严延生. 中国人兽共患病学报. 2016(08)
[8]人源抗H7N9血凝素中和抗体IgG的制备及鉴定[J]. 陈雅,熊四平,唐奇,王怡雯,耿以如,顾慧,徐亚如,周荧,仇镇宁,冯振卿,朱进. 南京医科大学学报(自然科学版). 2016(07)
[9]天山牦牛病毒性腹泻等传染病的血清学监测与调查[J]. 石琴,袁立岗,蒲敬伟,李静,徐晶晶,沙丽,杨晓丹,刘海东. 畜牧与兽医. 2015(06)
[10]BVDV、BCV和BRV三重RT-PCR检测方法的建立及应用[J]. 林初文,沈志强. 畜牧与兽医. 2013(07)
博士论文
[1]人源性抗汉滩病毒中和活性抗体的制备和鉴定[D]. 李卓.第四军医大学 2017
硕士论文
[1]驼源天然噬菌体纳米抗体展示库的构建和鉴定及抗GDH纳米抗体的筛选[D]. 方媛.宁夏医科大学 2019
[2]猪流行性腹泻病毒S蛋白特异性单域抗体的制备及鉴定[D]. 王莉鑫.内蒙古农业大学 2018
[3]犊牛冠状病毒和轮状病毒间接ELISA诊断方法的建立与初步应用[D]. 陆亚冬.石河子大学 2018
[4]噬菌体天然抗体库淘选及筛选方法的优化[D]. 蒋红欣.上海交通大学 2018
[5]猪流行性腹泻病毒S蛋白的表达及其特异性单域抗体的制备[D]. 赵鑫鑫.内蒙古农业大学 2017
[6]猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌体单链抗体库的构建与筛选[D]. 张秋丽.郑州大学 2017
[7]猪源噬菌体单链抗体库的构建及抗rSpaA单链抗体的筛选[D]. 王锐.湖南农业大学 2016
本文编号：3139801
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