口蹄疫病毒翻译起始区和2A关键位点对翻译起始及裂解效率的影响
发布时间：2021-04-20 15:21
口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus, FMDV）是感染偶蹄类动物的高度传染性疫病--口蹄疫的病原。其中FMDV内部核糖体进入位点（Internal ribosome entry site，IRES）和2A序列编码的2A寡肽在FMDV多聚蛋白翻译起始和裂解成熟过程中发挥着重要作用。FMDV IRES3’端存在两个功能性起始密码子，可分别表达Lab、Lb产物。FMDV优先选择第二个AUG作为起始位点，对于该两个AUG的选择机制是近来研究的热点。2A裂解位点位于2A序列C-端的甘氨酸与脯氨酸之间，而此甘氨酸的使用非常保守，因此该甘氨酸在2A序列中是非常重要的。本研究以FMDV IRES元件3’端两个功能性起始密码子周围序列和2A序列为研究对象，利用生物信息学技术对96条不同血清型的FMDV基因组序列中IRES元件下游两个具有翻译起始功能的AUG核苷酸三联体所处于的翻译起始序列环境和2A序列的密码子使用模式分别进行了分析。研究发现，FMDV的两个AUG所处的核苷酸环境具有明显的差异性，并且根据第一个、第二个AUG环境分别确定了劣势、优势翻译起始序列（-TTTA...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 口蹄疫病毒基因组结构
1.2 FMDV IRES 元件与 L 蛋白
1.2.1 IRES 元件
1.2.2 L 蛋白
1.3 FMDV 2A 序列结构及功能
1.4 密码子偏性
1.5 本研究的目的和技术路线
第二章 对 FMDV IRES 元件 3’端两个功能性起始密码子周围序列的分析
2.1 试验材料
2.2 序列分析
2.2.1 由两个起始密码子引导的整个编码序列的密码子偏性
2.2.2 GC 含量和靶序列的密码子偏性的计算
2.2.3 两个 AUG 周围对应环境的核苷酸偏好的计算
2.3 分析结果
2.4 讨论
第三章 IRES 引导的不同翻译起始序列对下游蛋白表达影响的分析
3.1 重组载体的构建和制备
3.1.1 试验材料
3.1.2 引物设计
3.1.3 CAT 基因的扩增
3.1.4 IRES 基因的扩增
3.1.5 EGFP 基因的扩增
3.1.6 PCR 产物的回收与纯化
3.1.7 CAT-IRES-EGFP 的融合
3.1.8 双酶切
3.1.9 连接
3.1.10 转化
3.1.11 质粒提取、双酶切及测序鉴定
3.1.12 无内毒素质粒的制备
3.2 重组载体的表达和鉴定
3.2.1 实验材料
3.2.2 细胞转染
3.2.3 重组载体表达鉴定
3.2.4 荧光观察
3.2.5 细胞处理
3.3 WESTERN-BLOTTING 分析
3.3.1 试验材料
3.3.2 聚丙烯凝胶电泳及转印
3.3.3 CAT 的检测
3.3.4 EGFP 的检测
3.3.5 结果分析
3.4 讨论
第四章 对 FMDV 2A 序列密码子的使用情况分析
4.1 试验材料
4.2 试验方法
4.2.1 2A 序列核苷酸使用偏性的计算
4.2.2 2A 序列连同 2B 序列的第一个密码子的真实密码子偏性的计算
4.2.3 2A 序列密码子的使用偏性累积的计算
4.3 试验结果
4.3.1 2A 序列的核苷酸使用偏性
4.3.2 2A 序列各位置的真实密码子偏性
4.3.3 2A 序列的密码子偏性累积
4.4 讨论
第五章 2A 序列 C-端甘氨酸同义密码子的改变对 2A 裂解效率影响的分析
5.1 重组载体的构建和制备
5.1.1 试验材料
5.1.2 引物设计
5.1.3 CAT-2A 的扩增
5.1.4 EGFP 基因的扩增
5.1.5 融合 PCR 反应
5.1.6 双酶切、连接、转化
5.1.7 质粒提取、双酶切及测序鉴定
5.1.8 重组载体的制备
5.2 重组载体的表达、鉴定
5.2.1 实验材料
5.2.2 细胞转染
5.2.3 重组载体表达鉴定
5.2.4 荧光观察
5.3 WESTERN-BLOTTING 分析
5.3.1 试验材料
5.3.2 试验方法
5.3.3 pCAT-2A-EGFP 系列重组质粒表达的 Western –Blotting 分析结果
5.4 讨论
第六章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3149931
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1.1 口蹄疫病毒基因组结构
1.2 FMDV IRES 元件与 L 蛋白
1.2.1 IRES 元件
1.2.2 L 蛋白
1.3 FMDV 2A 序列结构及功能
1.4 密码子偏性
1.5 本研究的目的和技术路线
第二章 对 FMDV IRES 元件 3’端两个功能性起始密码子周围序列的分析
2.1 试验材料
2.2 序列分析
2.2.1 由两个起始密码子引导的整个编码序列的密码子偏性
2.2.2 GC 含量和靶序列的密码子偏性的计算
2.2.3 两个 AUG 周围对应环境的核苷酸偏好的计算
2.3 分析结果
2.4 讨论
第三章 IRES 引导的不同翻译起始序列对下游蛋白表达影响的分析
3.1 重组载体的构建和制备
3.1.1 试验材料
3.1.2 引物设计
3.1.3 CAT 基因的扩增
3.1.4 IRES 基因的扩增
3.1.5 EGFP 基因的扩增
3.1.6 PCR 产物的回收与纯化
3.1.7 CAT-IRES-EGFP 的融合
3.1.8 双酶切
3.1.9 连接
3.1.10 转化
3.1.11 质粒提取、双酶切及测序鉴定
3.1.12 无内毒素质粒的制备
3.2 重组载体的表达和鉴定
3.2.1 实验材料
3.2.2 细胞转染
3.2.3 重组载体表达鉴定
3.2.4 荧光观察
3.2.5 细胞处理
3.3 WESTERN-BLOTTING 分析
3.3.1 试验材料
3.3.2 聚丙烯凝胶电泳及转印
3.3.3 CAT 的检测
3.3.4 EGFP 的检测
3.3.5 结果分析
3.4 讨论
第四章 对 FMDV 2A 序列密码子的使用情况分析
4.1 试验材料
4.2 试验方法
4.2.1 2A 序列核苷酸使用偏性的计算
4.2.2 2A 序列连同 2B 序列的第一个密码子的真实密码子偏性的计算
4.2.3 2A 序列密码子的使用偏性累积的计算
4.3 试验结果
4.3.1 2A 序列的核苷酸使用偏性
4.3.2 2A 序列各位置的真实密码子偏性
4.3.3 2A 序列的密码子偏性累积
4.4 讨论
第五章 2A 序列 C-端甘氨酸同义密码子的改变对 2A 裂解效率影响的分析
5.1 重组载体的构建和制备
5.1.1 试验材料
5.1.2 引物设计
5.1.3 CAT-2A 的扩增
5.1.4 EGFP 基因的扩增
5.1.5 融合 PCR 反应
5.1.6 双酶切、连接、转化
5.1.7 质粒提取、双酶切及测序鉴定
5.1.8 重组载体的制备
5.2 重组载体的表达、鉴定
5.2.1 实验材料
5.2.2 细胞转染
5.2.3 重组载体表达鉴定
5.2.4 荧光观察
5.3 WESTERN-BLOTTING 分析
5.3.1 试验材料
5.3.2 试验方法
5.3.3 pCAT-2A-EGFP 系列重组质粒表达的 Western –Blotting 分析结果
5.4 讨论
第六章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3149931
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