口蹄疫病毒非结构蛋白3A单抗结合肽的鉴定及阻断ELISA方法的建立

发布时间：2021-04-23 09:40

　　口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouthdisease virus, FMDV）引起的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病。该病的流行严重影响了畜产品市场与进出口贸易，因而受到世界各国的高度重视。我国对FMD的防控主要采取疫苗免疫和抗体监测为主的综合防控措施，FMD感染的快速诊断、免疫效果的评价与自然感染和疫苗免疫动物的鉴别诊断是口蹄疫防控的核心技术。本研究为鉴定一株口蹄疫病毒非结构蛋白3A的单克隆抗体3A24#所识别的表位区，对非结构蛋白3A分两个肽段进行原核表达，其中3A1和3A2肽段分别包含3A蛋白的第1⁸9位和77¹53位氨基酸。分别针对两个肽段基因设计合成引物，PCR扩增后克隆到原核表达载体pET-30a（+）-PES-SUMO，将重组质粒转化宿主菌E.coli BL21（DE3）pLys，IPTG诱导表达。用单克隆抗体3A24#对表达的3A1和3A2肽段进行western blot检测，以鉴定单抗3A24#的识别表位肽。SDS-PAGE分析表明，本试验成功表达了... 

【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Summary
缩略语
第一篇 文献综述
    1 研究目的与意义
    2 国内外研究进展
        2.1 口蹄疫病毒基因组的基本结构和功能
        2.2 口蹄疫病毒结构蛋白及其功能
        2.3 口蹄疫病毒非结构蛋白及其功能
        2.4 口蹄疫病毒抗原表位的研究进展
        2.5 口蹄疫 ELISA 检测方法的研究进展
            2.5.1 ELISA 在口蹄疫抗原表位研究中的应用
            2.5.2 ELISA 用于感染动物与免疫动物的鉴别诊断
            2.5.3 单克隆抗体在 ELISA 中的应用
        2.6 ELISA 技术的发展前景
第二篇 研究内容
    第一章 一株 3A 单抗识别表位的初步鉴定
        1 材料
            1.1 菌株、载体和质粒等
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2 实验方法
            2.1 3A 肽段基因的 PCR 扩增
                2.1.1 引物设计
                2.1.2 扩增 3a1 和 3a2 基因
                2.1.3 PCR 产物的回收与纯化
                2.1.4 PCR 产物与 pET-30a 载体的双酶切
                2.1.5 目的基因与载体的连接
                2.1.6 转化到感受态细胞
                2.1.7 重组质粒的提取与测序
            2.2 融合 3A 肽段的诱导表达
                2.2.1 重组质粒的诱导表达
                2.2.2 表达肽段的 SDS-PAGE 检测
            2.3 表位肽的 western blot 鉴定
        3 结果
            3.1 3a1 和 3a2 肽段基因的 PCR 扩增
            3.2 融合 3A1、3A2 肽段的诱导表达
            3.3 表位肽的 Western blot 鉴定
        4 讨论
    第二章 3A 单抗阻断 ELISA 方法的建立
        1 材料
            1.1 蛋白及抗体
            1.2 主要试剂
            1.3 标准血清
            1.4 血清样品的背景
            1.5 主要仪器
        2 方法
            2.1 非结构蛋白 2C 多克隆抗体的纯化
            2.2 非结构蛋白 3A 单克隆抗体的纯化
            2.3 非结构蛋白 3A 单克隆抗体的标记
            2.4 纯化 2C 多抗与 3A 单抗的鉴定
                2.4.1 纯化 2C 多抗与 3A 单抗的 SDS-PAGE 检测
                2.4.2 酶标 3A 单抗效价的检测
                2.4.3 纯化后 2C 多抗与酶标 3A 单抗蛋白浓度的测定
            2.5 建立 ELISA 方法流程
            2.6 滴定 2C3AB 抗原的工作浓度
            2.7 滴定 2C 多克隆抗体的工作浓度
            2.8 滴定 3A 单克隆抗体的工作浓度
            2.9 最佳血清稀释度的确定
            2.10 血清最佳反应时间及反应温度的确定
            2.11 制定 FMDV SPB-ELISA 的标准操作流程
            2.12 阴阳性判定标准的确定
        3 结果
            3.1 纯化 2C 多抗的 SDS-PAGE 分析
            3.2 纯化 3A 单抗的 SDS-PAGE 分析
            3.3 酶标 3A 单抗效价的检测
            3.4 非结构蛋白 2C 多抗、3A 单抗及 2C3AB 蛋白浓度的检测
            3.5 非结构蛋白 2C3AB 最佳工作浓度的确定结果
            3.6 非结构蛋白 2C 多抗最佳工作浓度的确定结果
            3.7 非结构蛋白 3A 单克隆抗体最佳工作浓度的确定结果
            3.8 最佳血清稀释度的确定结果
            3.9 血清最佳反应时间及反应温度的确定结果
            3.10 FMDV SPB-ELISA 的操作流程
            3.11 阴、阳性血清判定标准（临界值）的确定结果
        4 讨论
    第三章 3A 单抗阻断 ELISA 效果的评价
        1 材料
            1.1 血清样品背景
            1.2 相关试剂盒
            1.3 主要仪器
        2 方法
            2.1 特异性及敏感性检测
            2.2 与 PrioCHECK FMDV-NS ELISA 试剂盒和 FMD 3ABC I-ELISA 试剂盒的符合率对比
        3 结果
            3.1 特异性及敏感性判定结果
            3.2 与 PrioCHECK FMDV-NS ELISA 试剂盒和 FMD 3ABC I-ELISA 试剂盒的符合率对比
        4 讨论
全文结论
参考文献
致谢
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导师简介


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3155094