猪β-防御素-1的原核表达及其抗微生物活性

发布时间：2021-04-23 13:01

　　防御素（Defensin）是一类广泛分布于动物和植物界，富含精氨酸和半胱氨酸残基的阳离子内源性抗微生物肽，具有广泛的生物学活性，可抗细菌、囊膜病毒等多种病原微生物，并且具有不诱导细菌产生耐药性的特性。此外，防御素还具有免疫调节功能。因此，防御素被认为是一种新型抗生素，作为抗感染制剂具有广阔的应用前景。本论文首先构建了猪β-防御素-1（Porcineβ-defensin-1, PBD-1）原核表达质粒，表达了重组PBD-1，然后通过体内外试验检测了重组PBD-1的抗微生物活性，旨在为进一步研发新型治疗制剂奠定基础。应用RT-PCR获得了长为247bp的PBD-1全基因序列，首先构建了重组克隆载体pGM-T-PBD-1，进而构建了表达PBD-1成熟肽的重组表达载体PET-32a-PBD-1。然后在大肠杆菌BL21细胞中成功表达了24.5kDa的重组PBD-1。利用6×His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组PBD-1，获得了纯化的重组PBD-1。体外试验证明重组PBD-1对大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌、葡萄球菌和巴氏杆菌均具有不同程度的抗菌活性，随着重组PBD-1浓度的升高，抗菌活性随之增强。重组P... 

【文章来源】：河北农业大学河北省

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 防御素概述
        1.1.1 防御素的分类
        1.1.2 防御素的生物学活性
        1.1.3 防御素作用机理
        1.1.4 防御素基因的重组表达
        1.1.5 防御素的应用
    1.2 研究内容和技术路线
        1.2.1 研究内容
        1.2.2 技术路线
    1.3 研究目的与意义
    1.4 研究目标
    技术路线
2 材料
    2.1 毒株、菌株与载体
    2.2 实验用动物
    2.3 主要试剂
        2.3.1 RNA 提取试剂
        2.3.2 大肠杆菌感受态细胞制备及转化用溶液
        2.3.3 琼脂糖凝胶电泳用溶液
        2.3.4 诱导表达用液
        2.3.5 SDS-PAGE 电泳用溶液
        2.3.6 蛋白纯化回收和脱盐用液
        2.3.7 Western blot 用液
        2.3.8 细胞培养用溶液
        2.3.9 其它试剂
    2.4 主要仪器
3 方法
    3.1 引物设计与合成
    3.2 猪β-防御素-1 前体基因克隆载体的构建和鉴定
        3.2.1 猪总 RNA 分离提取
        3.2.2 RT-PCR
        3.2.3 猪β-防御素-1 前体基因 PCR 产物的纯化和回收
        3.2.4 猪β-防御素-1 前体基因和 pGM-T 载体的连接
        3.2.5 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备-CaCl2法
        3.2.6 重组质粒的转化
        3.2.7 重组质粒 DNA 的提取
        3.2.8 重组质粒酶切鉴定
        3.2.9 重组质粒 pGM-T-PBD-1 序列测定
    3.3 猪β-防御素-1 成熟肽基因表达载体的构建与鉴定
        3.3.1 猪β-防御素-1 成熟肽基因 PCR 扩增和纯化回收
        3.3.2 猪β-防御素-1 成熟肽基因和表达载体 PET-32a（+）的酶切
        3.3.3 猪β-防御素-1 成熟肽基因和 PET-32a（+）载体的连接
        3.3.4 重组表达载体 PET-32a（+）-PBD-1 的转化和质粒提取
        3.3.5 重组表达载体 PET-32a（+）-PBD-1 的鉴定
        3.3.6 大肠杆菌感受态细胞 BL21 的制备
        3.3.7 重组表达载体 PET-32a（+）-PBD-1 转化
    3.4 重组表达菌的诱导表达
        3.4.1 重组表达菌的诱导表达
        3.4.2 最佳表达条件的确定
        3.4.3 重组 PBD-1 的可溶性检测
    3.5 重组猪β-防御素-1 的纯化回收和脱盐
        3.5.1 纯化回收
        3.5.2 凝胶过滤法脱盐
        3.5.3 冷冻干燥
    3.6 重组猪β-防御素-1 的 Western blot 鉴定
    3.7 重组猪β-防御素-1 的抗微生物活性检测
        3.7.1 抗菌活性检测
        3.7.2 抗病毒活性检测
    3.8 动物试验
        3.8.1 试验动物分组与感染
        3.8.2 治疗
        3.8.3 肉眼病变检测
        3.8.4 显微镜检测
4 结果与分析
    4.1 猪β-防御素-1 基因的克隆
        4.1.1 猪β-防御素-1 全基因的 PCR 扩增
        4.1.2 猪β-防御素-1 克隆载体 pGM-T-PBD-1 的鉴定
        4.1.3 序列测定结果
    4.2 猪β-防御素-1 重组表达载体 PET-32a-PBD-1 的构建
    4.3 重组猪β-防御素-1 的表达及其最佳表达条件
        4.3.1 重组猪β-防御素-1 的表达
        4.3.2 最佳表达条件
        4.3.3 表达产物以包涵体形式存在
    4.4 表达产物的纯化和脱盐回收
        4.4.1 纯化
        4.4.2 脱盐回收
        4.4.3 冷冻干燥
    4.5 重组猪β-防御素-1 的 Western blot 鉴定
    4.6 重组猪β-防御素-1 抗微生物活性
        4.6.1 对常见细菌具有抑制活性
        4.6.2 对 PEDV 和禽流感病毒 H9N2 具有抑制活性
    4.7 动物试验
        4.7.1 临床症状
        4.7.2 体重
        4.7.3 感染率和死亡率
        4.7.4 病理变化
        4.7.5 病原分离与鉴定
5 讨论
    5.1 重组 PBD-1 克隆、表达载体的构建
    5.2 重组 PBD-1 的表达、纯化、脱盐和冷冻干燥处理
    5.3 重组 PBD-1 体外试验
    5.4 动物试验
6 结论
参考文献
在读期间发表的学术论文及获得的奖励
作者简介
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪β防御素2成熟肽在酵母中的表达[J]. 胡翰,于宾宾,何启盖.  微生物学报. 2011(05)
[2]猪β防御素2与猪γ干扰素在毕赤酵母中的融合表达及生物学活性比较[J]. 张定勇,孙蕾,杨利敏,刘文军.  生物工程学报. 2010(12)
[3]神经母细胞瘤24例临床和病理特点[J]. 江贤萍,周家秀,王国兵,祖莹,岳丽杰.  实用儿科临床杂志. 2010(18)
[4]猪PBD-1基因的克隆及其真核表达载体的构建[J]. 高其双,黄海军,邓兵,董斌科,刘艳,陶弼菲,向敏,吴建英,蒋思文.  中国兽医杂志. 2009(10)
[5]防御素的结构特点及抗肿瘤机制研究进展[J]. 冯艳,李明远.  肿瘤预防与治疗. 2008(04)
[6]动物防御素的功能及其应用[J]. 孙洁,祁克宗.  动物医学进展. 2005(09)
[7]人β-防御素在鼻黏膜上皮细胞中的表达及意义[J]. 王成硕,董震,杨占泉,关桂梅.  中国耳鼻咽喉颅底外科杂志. 2005(02)
[8]杂合抗菌肽CecAmil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达[J]. 张素芳,曹瑞兵,贾赟,周斌,陈溥言.  微生物学报. 2005(02)
[9]猪源抗菌肽的研究进展[J]. 韩军,杨汉春.  中国兽医杂志. 2004(05)
[10]C端带Myc和多聚组氨酸双标记的重组人β-防御素-2在COS-7细胞的转染表达[J]. 蔡绍晖,杜军,陈新年,黄宁,长濑文彦,长谷川高明,王伯瑶.  生物医学工程学杂志. 2003(02)

硕士论文
[1]β防御素2基因酵母工程菌的构建和表达[D]. 解民.河北农业大学 2008
[2]增强人α防御素3杀菌效率的研究[D]. 周立强.上海交通大学 2007



本文编号：3155377