副猪嗜血杆菌单克隆抗体的制备及其表位的鉴定
发布时间：2021-04-24 06:09
副猪嗜血杆菌（H.parasuis）是猪格拉瑟氏（Gl sser’s）病的病原体，该病主要症状为心包炎、多发性关节炎、纤维素性多发性浆膜炎和脑膜炎，也可引起败血症或无多发性浆膜炎的肺炎，并可以从健康猪的鼻腔分离到。Gl sser’s病可导致非免疫猪群的高发病率和高死亡率，是导致保育仔猪发病和死亡的重要原因之一，H.parasuis已成为国内外养猪业的重要致病菌，对养猪业造成较高的经济损失。目前免疫组化技术（IHC）、寡核苷酸特异性捕捉平板杂交实验（OSCPH）、聚合酶链式反应（PCR）等方法已应用于H.parasuis病原学检测，补体结合实验（CFT）、酶联免疫吸附实验（ELISA）、间接血凝实验（IHA）也已应用于H.parasuis血清学检测。但利用H.parasuis全菌制备的多克隆抗体（PcAb）因难以避免种间保守蛋白干扰，仍存在交叉反应现象；此外，基于16SrDNA的分子诊断技术也难以避免吲哚放线杆菌（A. indolicus）的干扰。总之，对H.parasuis特异性的抗原蛋白或核苷酸序列了解的匮乏造成了上述诊断方法在实际应用中受阻，鉴定种内保守而种间特异的抗原和抗原表位就...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 副猪嗜血杆菌概述
1.1.1 病原学特点
1.1.2 发病机理
1.1.3 流行病学特点
1.2 H.parasuis 感染的诊断方法的研究进展
1.3 H.parasuis 与毒力相关蛋白的研究进展
1.4 研究的目的和意义
第二章 H.parasuis MAb 的筛选及鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 细胞、菌株和实验动物
2.1.2 主要试剂与仪器
2.2 实验方法
2.2.1 动物的免疫
2.2.2 间接 ELISA 检测方法的建立
2.2.3 SP2/0 细胞的培养
2.2.4 饲养层细胞的制备
2.2.5 脾细胞的制备及细胞融合
2.2.6 阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆
2.2.7 阳性杂交瘤细胞株的保种和复苏
2.2.8 MAb 腹水的制备及效价测定
2.2.9 MAb 亚型的鉴定
2.2.10 杂交瘤细胞的染色体计数
2.2.11 MAb Western blot 鉴定
2.3 实验结果
2.3.1 间接 ELISA 方法最佳工作条件的建立
2.3.2 杂交瘤细胞株的制备及 MAb 亚型的鉴定
2.3.3 单克隆抗体效价的测定
2.3.4 杂交瘤细胞染色体计数结果
2.3.5 MAb Western blot 检测
2.4 讨论
第三章 MAb 1B3 识别蛋白的捕获及抗原表位的初步定位
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 MAb 1B3 免疫沉淀实验（IP）
3.2.2 免疫印迹分析
3.2.3 MAb 1B3 识别蛋白的质谱鉴定
3.2.4 MAb 1B3 的纯化
3.2.5 肽库的第 1 轮淘选
3.2.6 噬菌体的扩增
3.2.7 噬菌体的滴度测定
3.2.8 噬菌体的第 2、3 轮淘选
3.2.9 测序模板制备及其序列测定
3.2.10 噬菌体 ELISA
3.2.11 HPS-5 的 oppA 基因的测序
3.2.12 抗原表位的初步定位
3.3 结果
3.3.1 菌体蛋白的 IP 及 Western blot 鉴定
3.3.2 质谱鉴定
3.3.3 淘选产率
3.3.4 噬菌体 ELISA 检测结果
3.3.5 HPS-5 的 oppA 基因的测序
3.3.6 DNA 序列测定及表位分析
3.4 讨论
第四章 OppA 蛋白的反应原性验证
4.1 实验材料
4.1.1 细胞、菌株
4.1.2 主要试剂与仪器
4.2 实验方法
4.2.1 oppA 基因片段的克隆
4.2.2 pET-oppA 重组质粒的构建
4.2.3 pET-oppA 重组蛋白的原核表达及 Western blot 鉴定
4.2.4 抗原表位的精确定位及表位多肽的反应原性检测
4.2.5 OppA 蛋白的一致性分析
4.3 结果
4.3.1 oppA 基因的扩增
4.3.2 重组蛋白的表达及鉴定
4.3.3 抗原表位的精确定位及表位多肽的反应原性检测
4.3.4 OppA 蛋白的一致性分析
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3156830
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：45 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 副猪嗜血杆菌概述
1.1.1 病原学特点
1.1.2 发病机理
1.1.3 流行病学特点
1.2 H.parasuis 感染的诊断方法的研究进展
1.3 H.parasuis 与毒力相关蛋白的研究进展
1.4 研究的目的和意义
第二章 H.parasuis MAb 的筛选及鉴定
2.1 实验材料
2.1.1 细胞、菌株和实验动物
2.1.2 主要试剂与仪器
2.2 实验方法
2.2.1 动物的免疫
2.2.2 间接 ELISA 检测方法的建立
2.2.3 SP2/0 细胞的培养
2.2.4 饲养层细胞的制备
2.2.5 脾细胞的制备及细胞融合
2.2.6 阳性杂交瘤细胞株的筛选与克隆
2.2.7 阳性杂交瘤细胞株的保种和复苏
2.2.8 MAb 腹水的制备及效价测定
2.2.9 MAb 亚型的鉴定
2.2.10 杂交瘤细胞的染色体计数
2.2.11 MAb Western blot 鉴定
2.3 实验结果
2.3.1 间接 ELISA 方法最佳工作条件的建立
2.3.2 杂交瘤细胞株的制备及 MAb 亚型的鉴定
2.3.3 单克隆抗体效价的测定
2.3.4 杂交瘤细胞染色体计数结果
2.3.5 MAb Western blot 检测
2.4 讨论
第三章 MAb 1B3 识别蛋白的捕获及抗原表位的初步定位
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.2.1 MAb 1B3 免疫沉淀实验（IP）
3.2.2 免疫印迹分析
3.2.3 MAb 1B3 识别蛋白的质谱鉴定
3.2.4 MAb 1B3 的纯化
3.2.5 肽库的第 1 轮淘选
3.2.6 噬菌体的扩增
3.2.7 噬菌体的滴度测定
3.2.8 噬菌体的第 2、3 轮淘选
3.2.9 测序模板制备及其序列测定
3.2.10 噬菌体 ELISA
3.2.11 HPS-5 的 oppA 基因的测序
3.2.12 抗原表位的初步定位
3.3 结果
3.3.1 菌体蛋白的 IP 及 Western blot 鉴定
3.3.2 质谱鉴定
3.3.3 淘选产率
3.3.4 噬菌体 ELISA 检测结果
3.3.5 HPS-5 的 oppA 基因的测序
3.3.6 DNA 序列测定及表位分析
3.4 讨论
第四章 OppA 蛋白的反应原性验证
4.1 实验材料
4.1.1 细胞、菌株
4.1.2 主要试剂与仪器
4.2 实验方法
4.2.1 oppA 基因片段的克隆
4.2.2 pET-oppA 重组质粒的构建
4.2.3 pET-oppA 重组蛋白的原核表达及 Western blot 鉴定
4.2.4 抗原表位的精确定位及表位多肽的反应原性检测
4.2.5 OppA 蛋白的一致性分析
4.3 结果
4.3.1 oppA 基因的扩增
4.3.2 重组蛋白的表达及鉴定
4.3.3 抗原表位的精确定位及表位多肽的反应原性检测
4.3.4 OppA 蛋白的一致性分析
4.4 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3156830
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