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骆驼源和竹鼠源隐孢子虫的分离鉴定及种系发育分析

发布时间:2021-04-24 20:44
  隐孢子虫是一种危害严重的细胞内寄生原虫,它主要造成宿主不同程度的腹泻,其寄生范围很广,能感染包括人在内的260多种脊椎动物。研究发现,野生动物是隐孢子虫重要储存宿主,目前研究人员已在不同种类的野生动物身上发现了多个虫种。本实验尝试采用饱和蔗糖漂浮法,从两个黑熊养殖场、成都动物园、碧峰峡野生动物园、贵阳动物园、竹鼠养殖场的野生动物和从成都及雅安地区的大熊猫采集到的共1370份粪便样品中分离隐孢子虫;结合形态学和分子方法对其进行虫种鉴定,再分别采用MLST技术和gp60位点进行亚型鉴定;并对各基因位点测序获得的序列进行同源性分析和构建进化树,研究卵囊所属种类和基因分型地位。结果显示,本实验共分离得到一株骆驼源隐孢子虫和三株竹鼠源隐孢子虫。分离得到的骆驼源隐孢子虫卵囊在饱和蔗糖溶液中呈现淡紫色,残留体透明卵囊呈圆形或卵圆形。400×光镜下平均每个视野可观察到3个卵囊,测量50个卵囊其平均大小为7.03(5.87-7.95)×5.50(4.60~6.00)μm(n=50)。运用巢式PCR扩增出骆驼源隐孢子虫SCBC02分离株18SrRNA、COWP、CpA135三个基因位点序列,测序结果经矫正... 

【文章来源】:四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】:83 页

【学位级别】:硕士

【文章目录】:
摘要
ABSTRACT
文献综述
    1 隐孢子虫简介
    2 隐孢子虫的分类学和遗传多态性
    3 隐孢子虫的分子鉴定方法
    4 野生动物隐孢子虫研究现状
    5 骆驼隐孢子虫研究进展
    6 竹鼠隐孢子虫研究进展
第一章 野生动物隐孢子虫的检测与分离
    1 材料和方法
        1.1 主要试剂和仪器
        1.2 粪便样品采集
        1.3 检测方法
    2 实验结果
        2.1 隐孢子虫检出率
        2.2 隐孢子虫卵囊形态观察
    3 讨论
第二章 骆驼源隐孢子虫种系发育分析和动物交叉感染实验
    1 材料和方法
        1.1 主要试剂和仪器
        1.2 骆驼源隐孢子虫样品收集和处理
        1.3 卵囊DNA提取
        1.4 18S rRNA、COWP、CpA135基因PCR扩增
            1.4.1 PCR引物的设计与合成
            1.4.2 PCR反应体系与反应条件
            1.4.3 PCR扩增产物检测
            1.4.4 PCR扩增产物测序及序列提交
        1.5 MLST技术亚型鉴定
            1.5.1 PCR引物设计与合成
            1.5.2 PCR反应体系与反应条件
            1.5.3 PCR扩增产物检测及测序
        1.6 序列分析及进化树的构建
            1.6.1 Genbank相关序列搜索与下载
            1.6.2 进化树的构建
        1.7 骆驼源隐孢子虫的动物交叉感染试验
            1.7.1 交叉感染实验动物
            1.7.2 接种方法与接种剂量
            1.7.3 粪便监测
    2 实验结果
        2.1 PCR扩增产物结果
        2.2 测序结果
        2.3 交叉感染实验结果
        2.4 同源性分析
        2.5 系统发育分析
    3 讨论
第三章 竹鼠源隐孢子虫的分离鉴定和种系发育分析
    1 材料和方法
        1.1 主要试剂和仪器
        1.2 竹鼠源隐孢子虫样品收集和处理
        1.3 卵囊DNA提取
        1.4 18S rRNA、COWP、HSP70、CpA135、gp60、actin基因PCR扩增
            1.4.1 PCR引物的设计与合成
            1.4.2 PCR反应体系及与反应条件
            1.4.3 PCR扩增产物检测
            1.4.4 PCR扩增产物测序
            1.4.5 actin位点克隆
            1.4.6 序列分析及进化树的构建
    2 实验结果
        2.1 PCR扩增产物结果
        2.2 actin克隆结果
        2.3 测序结果
        2.4 同源性分析
        2.5 系统发育分析
    3 讨论
参考文献
致谢
附录一
附录二
攻读学位期间发表的学术论文目录



本文编号:3158048

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