表达IBDV-VP2新型重组乳酸菌的构建及其免疫效果的评价

发布时间：2021-04-27 19:14

　　乳酸菌（Lactic Acid Bacteria,LAB）是一类以乳酸为主要代谢产物的厌氧菌。早在几百年前,人们就利用乳酸菌生产酸奶等发酵食品,其安全特性已经被广泛认可。近年来,乳酸菌作为重组蛋白口服载体疫苗的潜力也备受关注。在过去的二十年中,许多乳酸菌菌株的生理学和遗传学特性已经被彻底地研究,一些菌株已经完成全基因组测序,并且开发出了多种基于乳酸乳球菌的遗传表达工具,其中NICE基因调控表达系统（Nisin-controlled gene expression system,NICE）就是一种简便、可控的表达系统,该系统通过纳克量级的nisin（来自乳酸菌自身的一种34个氨基酸的天然细菌素）即可激活并诱导目的基因的转录和表达,因此,该系统已被广泛应用于表达外源蛋白;此外,乳酸菌还有非诱导的组成型持续表达系统等。但是与相对成熟的酵母和大肠杆菌表达系统相比,乳酸菌表达系统普遍存在表达量不足、难以分泌等劣势,不利于重组乳酸菌的构建和外源目的蛋白的表达。本研究独创性地采用由NICE诱导表达系统和组成型持续表达系统组成的双启动子串联表达策略,构建了由单一质粒携带双启动子串联表达同一目的蛋白的新... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 乳酸菌概述
    1.2 乳酸菌作为载体
        1.2.1 菌株的选择
        1.2.2 表达方式的选择
        1.2.3 沙门氏菌侵袭蛋白RCK
        1.2.4 乳酸菌作为载体的展望
    1.3 传染性法氏囊病(IBD)
        1.3.1 IBD概述
        1.3.2 IBD流行病学
        1.3.3 IBD疫苗研究现状
    1.4 目的与意义
第二章 R-L.LACTIS-PGSA-VP2-RCK重组乳酸菌的构建及其免疫效果的评价
    2.1 材料
        2.1.1 质粒、菌株、毒株及实验动物
        2.1.2 主要试剂和仪器
    2.2 方法
        2.2.1 引物合成
        2.2.2 目的片段扩增
        2.2.3 目的片段的胶回收纯化
        2.2.4 NZ3900 感受态的制备
        2.2.5 重组质粒pNZ8149-pgsA-VP2-RCK构建
        2.2.6 电转化构建r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重组乳酸菌
        2.2.7 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重组乳酸菌的筛选鉴定
        2.2.8 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重组乳酸菌的诱导表达
        2.2.9 间接免疫荧光及流式细胞术鉴定蛋白锚定
        2.2.10 动物实验设计
        2.2.11 血清抗体滴度检测
        2.2.12 血清中和抗体的检测
        2.2.13 攻毒保护率
        2.2.14 统计学分析
    2.3 结果
        2.3.1 目的基因片段的扩增
        2.3.2 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重组乳酸菌的筛选及PCR鉴定
        2.3.3 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重组乳酸菌的酶切鉴定
        2.3.4 r-L.Lactis-pgsA-VP2-RCK重组乳酸菌的蛋白表达情况
        2.3.5 间接免疫荧光鉴定重组乳酸菌表面锚定目的蛋白
        2.3.6 流式细胞分析鉴定重组乳酸菌表面锚定目的蛋白
        2.3.7 血清ELISA抗体与中和抗体的检测结果
        2.3.8 攻毒保护率
    2.4 讨论
第三章 R-L.LACTIS-PNISA+P45-VP2-RCK重组乳酸菌的构建及其免疫效果的评价
    3.1 材料
        3.1.1 质粒、菌株、毒株及实验动物
        3.1.2 主要试剂和仪器
    3.2 方法
        3.2.1 引物合成
        3.2.2 目的片段扩增
        3.2.3 重组质粒pNZ8149-pnisA+p45-VP2-RCK的构建
        3.2.4 电转化构建r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌
        3.2.5 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌的筛选鉴定
        3.2.6 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌的诱导表达
        3.2.7 动物实验设计
        3.2.8 血清抗体滴度检测
        3.2.9 血清中和抗体检测
        3.2.10 攻毒保护率
        3.2.11 法氏囊指数统计
        3.2.12 统计学分析
    3.3 结果
        3.3.1 目的基因片段的扩增
        3.3.2 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌的筛选及PCR鉴定
        3.3.3 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌酶切鉴定
        3.3.4 r-L.Lactis-pnisA+p45-VP2-RCK重组乳酸菌蛋白表达情况
        3.3.5 血清ELISA抗体与中和抗体的检测结果
        3.3.6 攻毒保护率
        3.3.7 法氏囊指数统计
    3.4 讨论
第四章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]表达鸡IL-12重组乳酸乳球菌的构建及其生物学活性检测[J]. 刘琳琳,宋雨心,王文骞,潘青,祁小乐,高玉龙,刘长军,张艳萍,李凯,高立,王永强,王笑梅,崔红玉.  中国预防兽医学报. 2017(06)
[2]鸡传染性法氏囊病的研究进展[J]. 李潭清,宋勤叶,杨润德,高轩,刘兰亚.  安徽农业科学. 2008(35)
[3]乳酸菌作为口服疫苗载体的研究进展[J]. 余丽芸,王桂华,唐彦君.  生物技术通报. 2008(05)
[4]传染性法氏囊病及其病原分子生物学研究进展[J]. 何秀苗,阳秀英,韦平.  动物医学进展. 2007(02)
[5]Vaccination against Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus Using Recombinant T4 Bacteriophage Displaying Viral Protein VP2[J]. Yong-Chang CAO Quan-Cheng SHI Jing-Yun MA Qing-Mei XIE Ying-Zuo BI Genetic Engineering Laboratory,Animal Science College,South China Agricultural University,Guangzou 510642,China.  Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 2005(10)
[6]北京地区鸡传染性法氏囊病病原分离[J]. 周蛟,刘福致,陈丽永,王淑娟.  北京农业科技. 1982(05)



本文编号：3164012