禽致病性大肠杆菌cOmpT单克隆抗体的研制及其识别抗原表位的鉴定
发布时间：2021-05-06 12:10
旨在制备禽致病性大肠杆菌（APEC）染色体编码外膜蛋白（cOmpT）的特异性单克隆抗体,本研究利用实验室已构建的APEC cOmpT重组表达质粒pET-28a-compT,经IPTG诱导表达后,获得以包涵体形式存在的约36 ku的重组蛋白cOmpT,利用尿素浓度梯度透析复性获得纯化蛋白cOmpT,并以此免疫BALB/c小鼠。建立间接ELISA检测方法,最适抗原包被浓度为0.625μg·mL-1,最适血清稀释度为1∶6 400。4次免疫后取小鼠脾进行细胞融合,采用有限稀释法多轮筛选后得到3株能稳定分泌针对cOmpT蛋白的单克隆抗体,分别命名为1G8、2C3和2G3,均为IgG2b亚类。3株杂交瘤细胞上清ELISA抗体效价分别为1∶200、1∶3 200和1∶3 200。Western blot结果显示,3株单抗均能与cOmpT发生特异性反应,而不与其他受检菌发生交叉反应。运用原核表达系统对compT基因进行截短表达,对单克隆抗体针对的cOmpT抗原表位进行鉴定,结果显示单抗1G8、2C3和2G3识别的抗原表位分别是83DQDWMDS8...
【文章来源】：畜牧兽医学报. 2020,51(12)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【文章目录】：
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒及细胞
1.1.2 实验动物
1.1.3 主要试剂
1.2 方法
1.2.1 重组蛋白的诱导表达与纯化
1.2.2 动物免疫
1.2.3 间接ELISA检测方法的建立
1.2.4 细胞融合及筛选
1.2.5 单抗亚类鉴定
1.2.6 Western blot鉴定
1.2.7 单抗特异性鉴定
1.2.8 交叉反应性鉴定
1.2.9 抗原表位的初步定位
1.2.10 抗原表位的精确定位
1.2.11 抗原表位分析
2 结 果
2.1 重组蛋白的诱导表达与纯化
2.1.1 重组质粒的鉴定
2.1.2 重组蛋白的诱导表达
2.1.3 重组蛋白的纯化
2.2 间接ELISA方法的建立
2.3 小鼠血清效价的检测
2.4 细胞融合与筛选
2.5 抗体效价鉴定
2.6 单抗亚类鉴定
2.7 Western blot鉴定
2.8 单抗特异性鉴定
2.9 交叉反应性鉴定
2.10 抗原表位鉴定
2.10.1 抗原表位的初步定位
2.10.2 抗原表位的精确定位
2.11 抗原表位分析
3 讨 论
4 结 论
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗原表位鉴定方法的研究进展[J]. 孙娟,王愉涵,刘艳,郭进露,武丽涛,李冬民. 国外医学(医学地理分册). 2017(03)
[2]抗犬瘟热病毒核蛋白单克隆抗体的制备及其线性抗原表位鉴定[J]. 曹智刚,易立,程悦宁,仝明薇,李爽,王建科,林鹏,孙亚茹,程世鹏. 中国预防兽医学报. 2017(07)
[3]大肠杆菌外膜蛋白OmpC的生物信息学分析及表位多肽疫苗的重组预测[J]. 俱雄,党亚锋,刘祥,丁锐,陈琛,冯自立,张辰露. 河南农业大学学报. 2017(01)
[4]抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性[J]. 闫慧丽,席俊,高学梅,贺梦雪,陈哲,陆启玉. 浙江农业学报. 2016(05)
[5]重组大肠埃希菌外膜蛋白C的表达、纯化及多克隆抗体制备[J]. 俱雄,陈春琳,刘祥,王成祥,王令,吴三桥,张涛. 陕西理工学院学报(自然科学版). 2015(03)
[6]重组大肠杆菌外膜蛋白OmpT对小鼠免疫保护作用的研究[J]. 佟春玉,李润婷,呼瑞,丁兆凤,马金柱,宋佰芬,崔玉东. 中国预防兽医学报. 2013(08)
[7]表位疫苗的研究进展[J]. 李健,余传信. 中国热带医学. 2007(09)
[8]表位疫苗:疫苗研制新策略[J]. 王新军,张兆松. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2004(06)
[9]禽大肠杆菌外膜蛋白、脂多糖疫苗的免疫保护试验[J]. 高崧,吴晓东,张扬,刘秀梵,张如宽. 中国兽医学报. 2002(05)
硕士论文
[1]猪圆环病毒3型回顾性调查与cap蛋白单克隆抗体的研制[D]. 赵冬.扬州大学 2018
[2]大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达及免疫原性分析[D]. 俱雄.陕西理工学院 2016
[3]禽致病性大肠杆菌E058株compT、pompT基因突变株的构建及其致病性评价[D]. 陈娟.扬州大学 2016
[4]尿路致病性大肠埃希菌外膜蛋白T致病相关的功能研究[D]. 赵铁.南方医科大学 2012
本文编号：3171899
【文章来源】：畜牧兽医学报. 2020,51(12)北大核心CSCD
【文章页数】：11 页
【文章目录】：
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒及细胞
1.1.2 实验动物
1.1.3 主要试剂
1.2 方法
1.2.1 重组蛋白的诱导表达与纯化
1.2.2 动物免疫
1.2.3 间接ELISA检测方法的建立
1.2.4 细胞融合及筛选
1.2.5 单抗亚类鉴定
1.2.6 Western blot鉴定
1.2.7 单抗特异性鉴定
1.2.8 交叉反应性鉴定
1.2.9 抗原表位的初步定位
1.2.10 抗原表位的精确定位
1.2.11 抗原表位分析
2 结 果
2.1 重组蛋白的诱导表达与纯化
2.1.1 重组质粒的鉴定
2.1.2 重组蛋白的诱导表达
2.1.3 重组蛋白的纯化
2.2 间接ELISA方法的建立
2.3 小鼠血清效价的检测
2.4 细胞融合与筛选
2.5 抗体效价鉴定
2.6 单抗亚类鉴定
2.7 Western blot鉴定
2.8 单抗特异性鉴定
2.9 交叉反应性鉴定
2.10 抗原表位鉴定
2.10.1 抗原表位的初步定位
2.10.2 抗原表位的精确定位
2.11 抗原表位分析
3 讨 论
4 结 论
【参考文献】：
期刊论文
[1]抗原表位鉴定方法的研究进展[J]. 孙娟,王愉涵,刘艳,郭进露,武丽涛,李冬民. 国外医学(医学地理分册). 2017(03)
[2]抗犬瘟热病毒核蛋白单克隆抗体的制备及其线性抗原表位鉴定[J]. 曹智刚,易立,程悦宁,仝明薇,李爽,王建科,林鹏,孙亚茹,程世鹏. 中国预防兽医学报. 2017(07)
[3]大肠杆菌外膜蛋白OmpC的生物信息学分析及表位多肽疫苗的重组预测[J]. 俱雄,党亚锋,刘祥,丁锐,陈琛,冯自立,张辰露. 河南农业大学学报. 2017(01)
[4]抗Gly m Bd 28K单克隆抗体的制备及其免疫学特性[J]. 闫慧丽,席俊,高学梅,贺梦雪,陈哲,陆启玉. 浙江农业学报. 2016(05)
[5]重组大肠埃希菌外膜蛋白C的表达、纯化及多克隆抗体制备[J]. 俱雄,陈春琳,刘祥,王成祥,王令,吴三桥,张涛. 陕西理工学院学报(自然科学版). 2015(03)
[6]重组大肠杆菌外膜蛋白OmpT对小鼠免疫保护作用的研究[J]. 佟春玉,李润婷,呼瑞,丁兆凤,马金柱,宋佰芬,崔玉东. 中国预防兽医学报. 2013(08)
[7]表位疫苗的研究进展[J]. 李健,余传信. 中国热带医学. 2007(09)
[8]表位疫苗:疫苗研制新策略[J]. 王新军,张兆松. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2004(06)
[9]禽大肠杆菌外膜蛋白、脂多糖疫苗的免疫保护试验[J]. 高崧,吴晓东,张扬,刘秀梵,张如宽. 中国兽医学报. 2002(05)
硕士论文
[1]猪圆环病毒3型回顾性调查与cap蛋白单克隆抗体的研制[D]. 赵冬.扬州大学 2018
[2]大肠埃希菌外膜蛋白OmpC的原核表达及免疫原性分析[D]. 俱雄.陕西理工学院 2016
[3]禽致病性大肠杆菌E058株compT、pompT基因突变株的构建及其致病性评价[D]. 陈娟.扬州大学 2016
[4]尿路致病性大肠埃希菌外膜蛋白T致病相关的功能研究[D]. 赵铁.南方医科大学 2012
本文编号：3171899
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