生长抑素和皮质抑素双表达DNA疫苗的构建和鉴定及作用机制研究

发布时间：2021-05-10 17:23

　　双表达系统与单一表达系统相比,具有较大的优势,可以启动细胞核,同时表达两外源基因。生长抑素-皮质抑素真核双表达DNA疫苗,可以在真核细胞中同时表达生长抑素-乙肝表面抗原（S/2SS）和皮质抑素-乙肝表面抗原（S/CST14）两种融合蛋白质,可以刺激机体分别产生抗生长抑素（Somatostatin,SS）和皮质抑素（Cortistatin,CST）的两种抗体,同时中和内源性生长抑素和皮质抑素,进而促进生长。因此在理论上,生长抑素和皮质抑素双表达DNA疫苗的促生长效果应比单表达DNA疫苗强。本研究应用基因克隆、细胞培养、RT-PCR、细胞免疫荧光、Western blot和ELISA等技术,将皮质抑素14肽基因连接在乙肝表面抗原3’端和双拷贝生长抑素乙肝表面抗原片段克隆到具有IRES元件的双表达pIRES质粒上,构建生长抑素-皮质抑素真核双表达质粒（pIRES-S/CST14-S/2SS,以下简称双表达质粒）。然后,转染Hela和GH3细胞,以鉴定该质粒在真核细胞中的表达情况。最后,采用肌肉注射方式将3种浓度的双表达DNA疫苗免疫4周龄的昆明雌鼠,并以2种单表达质粒及其联合免疫、以及本实验... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：122 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
第一章 生长抑素和皮质抑素双表达DNA疫苗研究进展
    1 生长抑素生理生化作用及其研究进展
        1.1 生长抑素的生物学特性
        1.2 生长抑素的受体及生物学作用
    2 生长抑素DNA免疫进展及存在的主要问题
        2.1 合成肽生长抑素疫苗
        2.2 基因工程疫苗
        2.3 生长抑素DNA免疫
        2.4 生长抑素DNA免疫效果研究发展
    3 皮质抑素14肽(CST-14)生理生化作用及其研究进展
        3.1 前皮质抑素原的克隆
        3.2 前皮质抑素原在大脑中表达受到抑制
        3.3 CST-14的生理学性状
        3.4 皮质抑素的受体
        3.5 在中枢神经系统的附加功能
    4 基因疫苗免疫的安全性研究进展
        4.1 WHO及FDA对DNA疫苗安全性的有关规定
        4.2 基因整合的研究
    5 研究目的与意义
第二章 生长抑素和皮质抑素双表达DNA疫苗的构建与鉴定
    引言
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 结果与分析
        2.1 片段S/2SS的PCR扩增产物
        2.2 质粒pIRES、PVAX1-S/CST和PVAX1-S/CST14双酶切产物
        2.3 质粒pIRES-S/CST和pIRES-S/CST14的双酶切产物
        2.4 质粒pIRES-S/2SS双酶切产物
        2.5 质粒pIRES-S/CST14 -S/2SS双酶切产物
        2.6 质粒pIRES-S/CST14-S/2SS转染Hela细胞后的RT-PCR转录
        2.7 质粒pIRES-S/CST14-S/2SS转染Hela细胞后的蛋白表达
        2.8 双表达质粒转染Hela细胞后,细胞免疫荧光方法观察
    3 讨论
第三章 双表达质粒转染GH3细胞后的分泌作用及其受体表达水平变化
    引言
    1 材料和方法
        1.1 材料
        1.2 方法
        1.3 数据分析
    2 结果
        2.1 生长抑素和皮质抑素在GH3细胞表达
        2.2 细胞凋亡
        2.3 cAMP检测
        2.4 生长激素和催乳素的检测
        2.5 生长抑素受体的蛋白表达分析
    3 讨论
第四章 双表达DNA疫苗免疫小鼠的生长及免疫应答效果
    引言
    1 材料和方法
        1.1 质粒和菌株
        1.2 实验动物饲养管理
        1.3 疫苗的免疫及样品采集
        1.4 实验试剂及配制
        1.5 小鼠血液采集
        1.6 相关激素和抗体检测
        1.7 数据分析
    2 结果与分析
        2.1 小鼠的SS IgG水平检测
        2.2 免疫后SS抗体阳性小鼠的增重比较
        2.3 GH和CST激素检测
    3 讨论
第五章 生长抑素和皮质抑素双表达DNA疫苗安全性研究
    引言
    1 材料与方法
        1.1 材料
        1.2 方法
    2 结果分析
        2.1 小鼠组织总DNA内参基因的PCR结果
        2.2 生长抑素和皮质抑素融合目的基因扩增结果
    3 讨论
第六章 基因免疫方法学研究
    引言
    1 材料与方法
        1.1 质粒和细菌
        1.2 细菌菌株接种疫苗的制备
        1.3 疫苗的免疫
        1.4 体重数据和血清的采集
        1.5 间接ELISA方法检测抗体水平
        1.6 分析质粒的拷贝数以及在机体组织中的生物分布
        1.7 提取DNA试剂盒方法步骤
        1.8 统计分析
    2 结果
        2.1 生长抑素SS的IgG抗体水平
        2.2 抗生长抑素抗体IgG水平
        2.3 IgA抗体水平结果
        2.4 增重分析
        2.5 小鼠各种组织中质粒的拷贝数及生物分布
    3 讨论
全文总结
创新与不足
参考文献
附录Ⅰ: 已发表论文和专利
附录Ⅱ: 皮质抑素和生长抑素碱基序列
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]新型生长抑素原核表达质粒的构建及表达鉴定[J]. 梁爱心,冯细钢,韩丽,滑国华,桑雷,刘兴斌,刘耘,杨利国.  生物工程学报. 2008(06)
[2]双拷贝抑制素基因疫苗pcISI的构建和表达及免疫[J]. 曹少先,邢朝芳,张德坤,舒邓群,杨利国.  畜牧兽医学报. 2008(05)
[3]口服生长抑素基因疫苗对小肠局部细胞免疫的影响[J]. 严婷,杜念兴,杨倩.  免疫学杂志. 2006(S1)
[4]小鼠对pGM-CSF/SS生长抑素基因疫苗的免疫应答[J]. 梁爱心,姚艳丰,金定恩,武睿,韩丽,付平,刘耘,杨利国.  华中农业大学学报. 2006(05)
[5]生长抑素DNA疫苗pEGS/2SS在大鼠体内的表达与分布[J]. 曹少先,杨利国,茆达干,张文伟,邢朝芳.  南京农业大学学报. 2005(02)
[6]生长抑素基因疫苗pcS/SS构建及其在HeLa细胞中的表达[J]. 曹少先,杨利国,茆达干,张文伟,管峰.  中国兽医学报. 2004(02)
[7]生长抑素（SS）与硫氧还原蛋白（Thioredoxin）相融合生成的2种基因工程化融合蛋白SS-N/X和SS-N/S的表达特性[J]. 刘永庆,陈溥言,杜念兴,赵国屏.  中国兽医学报. 2003(02)
[8]增强以表位为基础的基因免疫效果的新策略[J]. 徐薇.  上海免疫学杂志. 2002(01)
[9]优化基因免疫治疗的新进展[J]. 罗红雨.  国外医学(免疫学分册). 2001(04)
[10]中枢生长抑素作用机制的研究[J]. 沈红芬.  国外医学.精神病学分册. 2001(01)

博士论文
[1]非抗性筛选生长抑素DNA疫苗的构建和免疫效力及安全性研究[D]. 梁爱心.华中农业大学 2009

硕士论文
[1]IL-6与GM-CSF基因融合表达生长抑素基因疫苗对小鼠生长的影响[D]. 赵兴华.华中农业大学 2010
[2]口服型生长抑素基因疫苗对小鼠肠道局部免疫效果的研究[D]. 严婷.南京农业大学 2006



本文编号：3179758