表达乙型脑炎病毒的主要免疫原性基因重组伪狂犬病毒的构建及生物特性的研究
发布时间：2021-05-13 14:29
日本乙型脑炎（Japanese encephalitis, JE）,简称乙脑,是由日本乙型脑炎病毒感染引起的一种蚊媒性人畜共患传染病。乙脑主要引起神经损伤和繁殖障碍,严重影响人类健康和养猪业的发展。免疫接种是目前控制日本乙型脑炎最有效的方法之一。但是目前常用灭活疫苗（P3毒株）和弱毒苗（SA14-14-2毒株）都是基于JEV基因Ⅲ型毒株研制,可能会对目前逐渐流行起来基因Ⅰ型JEV引发的乙型脑炎的预防与控制带来一些问题,研制针对JEV基因Ⅰ型的乙型脑炎疫苗就显得尤为重要。鉴于此,本研究以伪狂犬病病毒弱毒株TK-/gE-/LacZ+和TK-/gG-/PrM-E+/gE-/eGFP+为载体,构建表达基因Ⅰ型JEV的主要免疫原性蛋白PrM-E的重组伪狂犬病病毒,拟达到能够同时控制乙型脑炎和伪狂犬病病毒病的目的。主要研究内容如下：1.表达JEV主要免疫原性基因重组伪狂犬病病毒的构建及免疫效果的研究首先克隆出JEV SX09-S01毒株（基因Ⅰ型）结构蛋白PrM-E的基因序列,通过EcoRⅠ, BglⅡ酶切位点连接于pCA真核表达质粒形成pCA-PrM-E。用Sal Ⅰ和BglⅡ酶切质粒pCA-P...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
1 文献综述
1.1 流行乙型脑炎的流行病学特性
1.2 乙型脑炎病毒的病原学特征
1.3 JEV的分子生物学特征
1.3.1 基因组结构与功能
1.3.2 JEV基因组编码蛋白概况
1.4 乙型脑炎疫苗的研究进展
1.4.1 目前投入临床研究或使用的乙型脑炎疫苗
1.4.2 实验室研发阶段乙型脑炎疫苗
1.5 伪狂犬病以及伪狂犬病毒活载体的研究进展
2 研究目的和意义
3 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 毒株与细胞
3.1.2 菌株载体与质粒
3.1.3 主要工具酶及试剂
3.1.4 培养基及其配制方法
3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.6 本研究所用PCR引物
3.1.7 试验动物及试验地点
3.2 实验方法
3.2.1 JEV(SX09S-01)毒株的扩增
3.2.2 JEV(SX09S-01)毒株总RNA提取
3.2.3 JEV PrM-E基因的RT-PCR扩增
3.2.4 扩增并回收JEV PrM-E基因
3.2.5 连接JEV PrM-E片段于pMD18-T载体
3.2.6 连接产物的转化、挑菌及培养
3.2.7 质粒的小量制备(OMEGA小提试剂盒)
3.2.8 质粒的大量制备(OMEGA大提试剂盒)
3.2.9 PRV病毒基因组的提取
3.2.10 脂质体共转染法及空斑纯化
3.2.11 SDS-PAGE分析和Western blot检测
3.2.12 遗传稳定性与一步生长曲线
3.2.13 动物实验
3.2.14 实时荧光定量PCR检测干扰素相对表达水平
4 结果与分析
4.1 JEV PrM-E基因的克隆和序列的分析
4.1.1 JEV PrM-E基因的RT-PCR扩增
4.1.2 JEV PrM-E基因测序分析
4.2 转移质粒pIE-pCA-PrM-E的构建
4.3 重组PRV病毒的构建
4.3.1 重组PRV病毒构建策略及初步鉴定
4.3.2 重组病毒PRV TK-/gE-/PrM-E+的空斑纯化及PCR鉴定
4.3.3 重组病毒PRV TK~-/gG~-/PrM-E~+/gE~-/PrM-E~+的空斑纯化及PCR鉴定
4.4 重组病毒外源蛋白的western blot检测
4.5 重组病毒PRV TK~-/gE~-/PrM-E~+遗传稳定性鉴定
4.6 重组病毒PRV TK~-/gE~-/PrM-E~+一步生长曲线
4.7 小鼠动物试验研究
4.7.1 重组病毒诱导产生的ELISA抗体水平
4.7.2 重组病毒诱导产生的中和抗体水平
4.7.3 动物保护力实验
5 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 重组病毒研究
5.1.2 JEV疫苗研究的展望与设想
5.2 结论
参考文献
致谢
本文编号：3184182
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表(Abbreviation)
1 文献综述
1.1 流行乙型脑炎的流行病学特性
1.2 乙型脑炎病毒的病原学特征
1.3 JEV的分子生物学特征
1.3.1 基因组结构与功能
1.3.2 JEV基因组编码蛋白概况
1.4 乙型脑炎疫苗的研究进展
1.4.1 目前投入临床研究或使用的乙型脑炎疫苗
1.4.2 实验室研发阶段乙型脑炎疫苗
1.5 伪狂犬病以及伪狂犬病毒活载体的研究进展
2 研究目的和意义
3 材料与方法
3.1 实验材料
3.1.1 毒株与细胞
3.1.2 菌株载体与质粒
3.1.3 主要工具酶及试剂
3.1.4 培养基及其配制方法
3.1.5 主要缓冲液与相关试剂及其配制
3.1.6 本研究所用PCR引物
3.1.7 试验动物及试验地点
3.2 实验方法
3.2.1 JEV(SX09S-01)毒株的扩增
3.2.2 JEV(SX09S-01)毒株总RNA提取
3.2.3 JEV PrM-E基因的RT-PCR扩增
3.2.4 扩增并回收JEV PrM-E基因
3.2.5 连接JEV PrM-E片段于pMD18-T载体
3.2.6 连接产物的转化、挑菌及培养
3.2.7 质粒的小量制备(OMEGA小提试剂盒)
3.2.8 质粒的大量制备(OMEGA大提试剂盒)
3.2.9 PRV病毒基因组的提取
3.2.10 脂质体共转染法及空斑纯化
3.2.11 SDS-PAGE分析和Western blot检测
3.2.12 遗传稳定性与一步生长曲线
3.2.13 动物实验
3.2.14 实时荧光定量PCR检测干扰素相对表达水平
4 结果与分析
4.1 JEV PrM-E基因的克隆和序列的分析
4.1.1 JEV PrM-E基因的RT-PCR扩增
4.1.2 JEV PrM-E基因测序分析
4.2 转移质粒pIE-pCA-PrM-E的构建
4.3 重组PRV病毒的构建
4.3.1 重组PRV病毒构建策略及初步鉴定
4.3.2 重组病毒PRV TK-/gE-/PrM-E+的空斑纯化及PCR鉴定
4.3.3 重组病毒PRV TK~-/gG~-/PrM-E~+/gE~-/PrM-E~+的空斑纯化及PCR鉴定
4.4 重组病毒外源蛋白的western blot检测
4.5 重组病毒PRV TK~-/gE~-/PrM-E~+遗传稳定性鉴定
4.6 重组病毒PRV TK~-/gE~-/PrM-E~+一步生长曲线
4.7 小鼠动物试验研究
4.7.1 重组病毒诱导产生的ELISA抗体水平
4.7.2 重组病毒诱导产生的中和抗体水平
4.7.3 动物保护力实验
5 讨论与结论
5.1 讨论
5.1.1 重组病毒研究
5.1.2 JEV疫苗研究的展望与设想
5.2 结论
参考文献
致谢
本文编号：3184182
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