猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218功能域解析及体内抗菌活性研究
发布时间：2021-05-13 20:46
猪链球菌（Streptococcus suis）是一种人兽共患病原菌,感染仔猪可导致患关节炎、败血症和脑膜炎等,对养猪业以及公共卫生均构成非常严重的威胁。目前,对猪链球菌病菌的防控主要依赖抗生素治疗,但抗生素的滥用,导致临床分离的多数病原菌株呈现严重耐药和多重耐药特性,细菌耐药问题日趋严重,阻碍了该病的有效防控,因此发掘新的抗菌制剂尤为重要;来源于噬菌体的裂解酶（Lysin）具有高效、快速杀菌,特异性强,且不易产生耐药性等特点,是一种潜在的新型抗菌制剂。本研究基于猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218在体外裂菌和在小鼠体内抗感染的良好效果,应用Ply5218对发病仔猪进行治疗。选用20 kg大小的仔猪,采取“颈部攻击-裂解酶治疗”策略,评价Ply5218的体内抗感染效果。将16只仔猪随机分成四组,分别为攻击未治疗组、未攻击治疗组,攻击后立即治疗组和攻击后延迟1 h治疗组。攻击组仔猪均经颈部肌肉注射10 mL（1.4×10100 CFU/mL）复壮的猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,SS2）强毒株HA9801,然后分别立即注射10...
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
1.1 猪链球菌研究概况
1.1.1 猪链球菌2型研究概况
1.1.2 猪链球菌的耐药性现状
1.2 猪链球菌噬菌体研究概况
1.2.1 噬菌体概述
1.2.2 噬菌体的分类
1.2.3 噬菌体浸染细菌机制
1.2.4 猪链球菌噬菌体研究进展
1.3 噬菌体裂解酶研究概况
1.3.1 噬菌体裂解酶概况
1.3.2 猪链球菌裂解酶研究概况
1.3.3 裂解酶的独特优势及应用发展
1.4 表达系统研究概况
1.4.1 重组蛋白表达系统比较
1.4.2 酵母表达系统
1.4.3 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点
1.5 本研究的目的与意义
第二章 裂解酶PLY5218治疗仔猪猪链球菌2型感染研究
2.1 材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 主要试剂
2.2 方法
2.2.1 重组质粒转化到表达菌BL21
2.2.2 Ply5218蛋白的表达及纯化
2.2.3 裂解酶的安全性评估
2.2.4 仔猪感染链球菌HA801治疗方案
2.3 结果
2.3.1 重组质粒转化到表达菌BL21
2.3.2 Ply5218蛋白的表达及纯化
2.3.3 裂解酶的安全性评估
2.3.4 仔猪感染链球菌HA801治疗方案
2.4 讨论
第三章 裂解酶PLY5218的真核表达及活性研究
3.1 材料
3.1.1 菌株及载体
3.1.2 主要试剂和酶
3.1.3 实验动物
3.2 方法
3.2.1 Ply5218密码子优化
3.2.2 酵母感受态细胞的制作
3.2.3 Ply5218表达菌株的构建
3.2.4 裂解酶Ply5218真核表达及活性初筛
3.2.5 诱导条件的优化
3.2.6 蛋白的纯化
3.2.7 酶活性的测定
3.2.8 确定HA9801攻毒量
3.2.9 ICR小鼠治疗实验
3.3 结果
3.3.1 Ply5218密码子优化
3.3.2 酵母感受态细胞的制作
3.3.3 Ply5218表达菌株的构建
3.3.4 裂解酶Ply5218真核表达及活性初筛
3.3.5 诱导条件的优化
3.3.6 蛋白的纯化
3.3.7 酶活性的测定
3.3.8 确定HA9801攻毒量
3.3.9 ICR小鼠治疗实验
3.4 讨论
第四章 PLY5218活性域及关键氨基酸位点的鉴定
4.1 材料
4.2 方法
4.2.1 目的基因的分段截短及表达菌株的构建
4.2.2 截短片段的表达及活性检测
4.2.3 关键氨基酸位点的选择与突变
4.2.4 突变体表达质粒的构建、表达及活性检测
4.2.5 裂解酶Ply5218与突变蛋白的活性比较
4.3 结果
4.3.1 目的基因的分段截短及表达菌株的构建
4.3.2 截短片段的表达及活性检测
4.3.3 关键氨基酸位点的选择与突变
4.3.4 突变株表达质粒的构建,表达及活性检测
4.3.5 裂解酶Ply5218与突变蛋白的活性比较
4.4 讨论
第五章 全文总结
参考文献
附录 试剂配制
致谢
本研究受以下项目资助
攻读硕士学位期间已发表或录用的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]重庆地区猪肉样品中猪链球菌污染、血清型、耐药性及致病性[J]. 彭少静,邓华英,张媛媛,胡书月,丁玲玲,李继祥. 食品科学. 2016(04)
[2]高效广谱猪链球菌7型前噬菌体裂解酶的挖掘及活性研究[J]. 黄庆庆,吉文汇,杜斌,程玉强,孙建和. 微生物学通报. 2015(06)
[3]46株猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性及PFGE分型[J]. 黄金虎,刘民星,商可心,王丽平. 南京农业大学学报. 2013(04)
[4]蝎毒镇痛活性肽基因BmK AngM1的密码子优化及其真核表达分析[J]. 杨金玲,高丽丽,朱平,侯琦,王芬,于文博,聂涛. 药学学报. 2012(10)
[5]猪链球菌2型的分离鉴定及致病性试验[J]. 刘丽蓉,常凯,单虎. 畜牧与兽医. 2011(12)
[6]猪链球菌2型西藏小型猪感染模型的初步建立[J]. 周玉岩,李春玲,余炜烈,王贵平. 动物医学进展. 2011(04)
[7]四川省一起伴中毒性休克综合征的人感染猪链球菌2型暴发[J]. 杨维中,余宏杰,景怀琦,徐建国,陈志海,祝小平,汪华,刘学成,王世文,刘伦光,祖荣强,罗隆泽,向妮娟,刘红露,钟文君,刘莉,孟玲,袁珩,高永军,杜化茂,欧阳宾,叶长芸,金冬,吕强,崔志刚,黄燕,张守印,安向东,黄婷,周兴余,冯燎,庞启迪,舒跃龙,王宇. 中华流行病学杂志. 2006(03)
[8]东亚钳蝎毒素BmαTX14的基因组克隆、真核表达纯化及功能的初步研究[J]. 吕猛,王昆,曹志贱,蒋达和,毛歆,李文鑫. 生物工程学报. 2005(06)
[9]32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性[J]. 王丽平,陆承平,唐家琪. 微生物学报. 2004(06)
[10]巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 王黎明,王琦,梅汝鸿. 微生物学杂志. 2004(02)
硕士论文
[1]应用金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15治疗乳房炎的实验研究[D]. 肖峰.吉林大学 2015
[2]金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体治疗乳房炎的实验研究[D]. 李跃.吉林大学 2014
本文编号：3184679
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述
1.1 猪链球菌研究概况
1.1.1 猪链球菌2型研究概况
1.1.2 猪链球菌的耐药性现状
1.2 猪链球菌噬菌体研究概况
1.2.1 噬菌体概述
1.2.2 噬菌体的分类
1.2.3 噬菌体浸染细菌机制
1.2.4 猪链球菌噬菌体研究进展
1.3 噬菌体裂解酶研究概况
1.3.1 噬菌体裂解酶概况
1.3.2 猪链球菌裂解酶研究概况
1.3.3 裂解酶的独特优势及应用发展
1.4 表达系统研究概况
1.4.1 重组蛋白表达系统比较
1.4.2 酵母表达系统
1.4.3 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点
1.5 本研究的目的与意义
第二章 裂解酶PLY5218治疗仔猪猪链球菌2型感染研究
2.1 材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 主要试剂
2.2 方法
2.2.1 重组质粒转化到表达菌BL21
2.2.2 Ply5218蛋白的表达及纯化
2.2.3 裂解酶的安全性评估
2.2.4 仔猪感染链球菌HA801治疗方案
2.3 结果
2.3.1 重组质粒转化到表达菌BL21
2.3.2 Ply5218蛋白的表达及纯化
2.3.3 裂解酶的安全性评估
2.3.4 仔猪感染链球菌HA801治疗方案
2.4 讨论
第三章 裂解酶PLY5218的真核表达及活性研究
3.1 材料
3.1.1 菌株及载体
3.1.2 主要试剂和酶
3.1.3 实验动物
3.2 方法
3.2.1 Ply5218密码子优化
3.2.2 酵母感受态细胞的制作
3.2.3 Ply5218表达菌株的构建
3.2.4 裂解酶Ply5218真核表达及活性初筛
3.2.5 诱导条件的优化
3.2.6 蛋白的纯化
3.2.7 酶活性的测定
3.2.8 确定HA9801攻毒量
3.2.9 ICR小鼠治疗实验
3.3 结果
3.3.1 Ply5218密码子优化
3.3.2 酵母感受态细胞的制作
3.3.3 Ply5218表达菌株的构建
3.3.4 裂解酶Ply5218真核表达及活性初筛
3.3.5 诱导条件的优化
3.3.6 蛋白的纯化
3.3.7 酶活性的测定
3.3.8 确定HA9801攻毒量
3.3.9 ICR小鼠治疗实验
3.4 讨论
第四章 PLY5218活性域及关键氨基酸位点的鉴定
4.1 材料
4.2 方法
4.2.1 目的基因的分段截短及表达菌株的构建
4.2.2 截短片段的表达及活性检测
4.2.3 关键氨基酸位点的选择与突变
4.2.4 突变体表达质粒的构建、表达及活性检测
4.2.5 裂解酶Ply5218与突变蛋白的活性比较
4.3 结果
4.3.1 目的基因的分段截短及表达菌株的构建
4.3.2 截短片段的表达及活性检测
4.3.3 关键氨基酸位点的选择与突变
4.3.4 突变株表达质粒的构建,表达及活性检测
4.3.5 裂解酶Ply5218与突变蛋白的活性比较
4.4 讨论
第五章 全文总结
参考文献
附录 试剂配制
致谢
本研究受以下项目资助
攻读硕士学位期间已发表或录用的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]重庆地区猪肉样品中猪链球菌污染、血清型、耐药性及致病性[J]. 彭少静,邓华英,张媛媛,胡书月,丁玲玲,李继祥. 食品科学. 2016(04)
[2]高效广谱猪链球菌7型前噬菌体裂解酶的挖掘及活性研究[J]. 黄庆庆,吉文汇,杜斌,程玉强,孙建和. 微生物学通报. 2015(06)
[3]46株猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性及PFGE分型[J]. 黄金虎,刘民星,商可心,王丽平. 南京农业大学学报. 2013(04)
[4]蝎毒镇痛活性肽基因BmK AngM1的密码子优化及其真核表达分析[J]. 杨金玲,高丽丽,朱平,侯琦,王芬,于文博,聂涛. 药学学报. 2012(10)
[5]猪链球菌2型的分离鉴定及致病性试验[J]. 刘丽蓉,常凯,单虎. 畜牧与兽医. 2011(12)
[6]猪链球菌2型西藏小型猪感染模型的初步建立[J]. 周玉岩,李春玲,余炜烈,王贵平. 动物医学进展. 2011(04)
[7]四川省一起伴中毒性休克综合征的人感染猪链球菌2型暴发[J]. 杨维中,余宏杰,景怀琦,徐建国,陈志海,祝小平,汪华,刘学成,王世文,刘伦光,祖荣强,罗隆泽,向妮娟,刘红露,钟文君,刘莉,孟玲,袁珩,高永军,杜化茂,欧阳宾,叶长芸,金冬,吕强,崔志刚,黄燕,张守印,安向东,黄婷,周兴余,冯燎,庞启迪,舒跃龙,王宇. 中华流行病学杂志. 2006(03)
[8]东亚钳蝎毒素BmαTX14的基因组克隆、真核表达纯化及功能的初步研究[J]. 吕猛,王昆,曹志贱,蒋达和,毛歆,李文鑫. 生物工程学报. 2005(06)
[9]32种抗菌药物对临床分离猪源链球菌的体外抗菌活性[J]. 王丽平,陆承平,唐家琪. 微生物学报. 2004(06)
[10]巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展[J]. 王黎明,王琦,梅汝鸿. 微生物学杂志. 2004(02)
硕士论文
[1]应用金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶LysGH15治疗乳房炎的实验研究[D]. 肖峰.吉林大学 2015
[2]金黄色葡萄球菌裂解性噬菌体治疗乳房炎的实验研究[D]. 李跃.吉林大学 2014
本文编号：3184679
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/dongwuyixue/3184679.html
