鸡Leptin受体基因调控途径及功能研究
发布时间：2021-05-14 11:19
Leptin基因序列于1994年首次在小鼠和人类上被报道以来，其在哺乳动物生理功能的研究已经取得了显著的进展，具有调节能量和脂肪代谢，影响采食量，调节繁殖性状，影响免疫等多种生物学功能，尤其是其作为调节能量、脂肪、采食的启动基因之一，具有极高的应用价值。而家禽Leptin基因的研究相对进展缓慢，最大的制约因素是禽源Leptin是否存在未有定论。有多个报道声称其成功克隆到Leptin基因序列；但同时也有多个实验室在相同条件下不能重复前者的实验。质疑者的主要依据是克隆到的Leptin序列同哺乳类相似度极高，甚至超过了哺乳动物之间Leptin基因序列的相似度；而且自鸡的基因组测序工作完成以来，也一直无法在基因组中检索到已报道的Leptin基因序列。而鸡Leptin受体基因（cLEPR）序列和基因表达是肯定存在的。目前已经发现了其两种异构体存在，LEPR在哺乳动物上，作为Leptin基因的受体基因，对Leptin功能的发挥起到至关重要的作用，参与了多个代谢通路的调控。如果在鸡的基因组中不存在Leptin基因，一切有关鸡Leptin功能的研究除证明鸡Leptin受体的存在外，没有任何生理上的重要...
【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
缩略词表
前言
第一章 文献综述
1.Leptin及其受体基因的发现及相关研究
1.1 Leptin基因的发现
1.2 Leptin受体基因的发现
1.3 Leptin及其受体分子调控通路研究
1.3.1 Leptin及其受体介导的的JAK/STAT信号通路研究进展
1.3.2 Leptin及其受体介导的SOCS3信号通路研究进展
1.3.3 Leptin及其受体介导的AMPK信号转导途径
1.3.4 Leptin主要代谢通路研究小结
1.4 Leptin及其受体的生物学功能研究相关进展
1.4.1 Leptin及其受体与生长发育
1.4.2 Leptin对生殖相关激素的影响
1.4.3 Leptin与青春期启动的关联
1.4.4 Leptin对妊娠的调控作用
1.4.5 Leptin与免疫之间的关系
1.4.6 Leptin及其受体其它生物学功能小结
2.家禽Leptin及受体相关研究进展
2.1 家禽Leptin基因研究与争议
2.1.1 家禽Leptin争议的由来
2.1.2 外源Leptin对家禽的影响
2.2 家禽Leptin受体基因功能研究
2.3 家禽Leptin及其受体研究综述小结
3.转基因鸡研究进展
3.1 转基因鸡制备技术进展
3.1.1 显微注射法
3.1.2 逆转录病毒载体法
3.1.3 胚胎干细胞法
3.1.4 原生殖细胞(PGCs)转染法
3.1.5 雄性生殖细胞载体法
3.2 RNAi技术在转基因家禽上的应用
3.2.1 RNAi技术同转基因技术的结合过程
3.2.2 RNAi技术应用于转基因家禽
第二章 鸡Leptin序列克隆的验证及LEPR组织表达谱分析
1.材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 实验主要仪器
1.1.3 主要试剂及配方
1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA提取
1.2.2 组织RNA提取
1.2.3 PCR引物设计
1.2.4 PCR扩增程序
1.2.5 PCR引物设计与扩增
1.2.6 实时定量PCR数据分析
2.结果与分析
2.1 DNA及组织RNA提取结果
2.2 Leptin基因PCR扩增结果
2.3 LEPR荧光定量结果
3.讨论
3.1 鸡Leptin基因存在的争议
3.2 鸡LEPR基因的组织表达谱分析
第三章 RNAi验证LEPR在鸡前脂肪细胞中的功能及代谢通路变化
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 实验仪器
1.1.3 主要试剂、抗体及配方
1.2 实验方法
1.2.1 细胞的分离与培养
1.2.2 细胞的冻存复苏
1.2.3 shRNA干扰片段设计
1.2.4 载体PLLU2G-shLEPR的构建
1.2.5 质粒提取
1.2.6 脂质体转染鸡前脂肪细胞
1.2.7 细胞RNA的提取、反转录
1.2.8 荧光定量PCR分析
1.2.9 鸡前脂肪细胞的诱导分化
2.结果与分析
2.1 鸡前体脂肪细胞培养结果
2.2 RNAi质粒载体的构建
2.2.1 用XhoⅠ和HpaⅠ酶切PLLU2G骨架载体
2.2.2 菌落PCR鉴定PLLU2G-shLEPR图谱
2.2.3 载体测序结果
2.3 shLEPR质粒转染鸡前脂肪细胞的荧光检测结果
2.4 质粒干扰效率检测
2.4.1 转染后细胞RNA提取结果
2.4.2 反转录后内参基因检测
2.4.3 待测基因的PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳检测
2.4.4 荧光定量溶解曲线检测
2.4.5 荧光定量PCR的干扰效率检测结果
2.5 RNAi处理后各基因表达量分析
2.5.1 RNAi处理后基因表达量初步统计
2.5.2 RNAi处理基因表达量分析
2.6 RNAi处理后对细胞增殖速度的影响
3.讨论
3.1 鸡前脂肪细胞培养与诱导分化
3.1.1 鸡前脂肪细胞培养及诱导分化体系的建立
3.1.2 不同shLEPR组别细胞增殖结果
3.2 RNAi干扰后各基因表达量变化
3.2.1 shLERR干扰效率分析
3.2.2 shLEPR干扰后相关基因表达分析
3.3 shLEPR干扰前脂肪细胞研究小结
第四章 不同饲养条件下LEPR及其代谢通路基因表达变化分析
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 实验仪器
1.1.3 实验试剂及配置
1.2 实验方法
1.2.1 实验用鸡的饲养分组与饲养方式
1.2.2 组织RNA的提取及反转录
1.2.3 荧光定量检测基因表达量
2.结果与分析
2.1 体重测定结果
2.2 禁食及正常饲喂组荧光定量差异分析实验结果
2.2.1 荧光定量数据
2.2.2 各基因表达柱状图分析
3.讨论
3.1 禁食3天对体重增加的调整
3.2 禁食及正常饲喂组荧光定量差异分析
3.2.1 STAT3和NPY基因表达变化
3.2.2 AdipoR2基因和CPT-1基因表达变化
3.2.3 LEPR基因表达变化综合分析
3.3 禁食对LEPR等基因影响研究小结
第五章 shLEPR转基因鸡的构建及相关检测
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 实验仪器
1.1.3 实验试剂及配置
1.2 实验方法
1.2.1 shLEPR转染用种蛋的处理
1.2.2 转基因个体绿色荧光蛋白观测
1.2.3 转基因个体基因组PCR检测
1.2.4 转基因个体Western-blot鉴定
1.2.5 转基因个体体重、体尺测量及相关器官重量测量
1.2.6 转基因个体相关基因表达量检测
2.结果及分析
2.1 shLEPR转基因测定
2.1.1 孵化率统计
2.1.2 荧光信号检测
2.1.3 转基因结果分子检测
2.2 shLEPR转基因结果分析
2.2.1 转基因个体表型性状结果与分析
2.2.2 转基因个体相关通路基因表达变化
3.讨论
3.1 shLEPR转基因效果讨论
3.1.1 胚盘下腔注射效果分析
3.1.2 转基因结果检测与分析
3.2 LEPR干扰后个体表型及基因通路变化分析
3.2.1 LEPR基因表达及表型分析
3.2.2 相关基因表达量分析
3.3 shLEPR转基因讨论小结
全文结论及创新点
全文结论
创新点
参考文献
附表
附表1 干扰质粒载体测序结果
作者简介
致谢
导师评阅表
【参考文献】：
期刊论文
[1]转基因鸡生产技术研究进展[J]. 王鹤,王彦彬,康相涛. 河南农业科学. 2012(05)
[2]甲状腺素和葡萄糖对鸡前脂肪细胞增殖和THRSPα基因表达的影响[J]. 闫文龙,朱晓彤,王荣梅,C.d’André Hirwa,杨关福,张细权. 华北农学报. 2011(04)
[3]STAT5b基因的遗传多态性及其与京海黄鸡体重和繁殖性状的关联分析[J]. 赵秀华,王金玉,张跟喜,金崇富,顾玉萍,俞亚波,施会强. 畜牧与兽医. 2011(08)
[4]Leptin介导的JAK/STAT信号通路对脂类代谢调节的研究进展[J]. 王文正,赵素梅,高士争. 中国细胞生物学学报. 2011(05)
[5]Leptin介导的SOCS3信号通路研究进展[J]. 冷俊楠,赵素梅,高士争. 云南农业大学学报(自然科学版). 2011(03)
[6]鸡脂肪细胞分化调控的研究进展[J]. 商周春,王宇祥,郭琳,王宁,李辉. 黑龙江畜牧兽医. 2011(03)
[7]鸡胚电转染-RNA干扰技术在体模型的建立[J]. 陈大为,李瑞国,刘佳利. 中国实验动物学报. 2010(05)
[8]胚盘下腔注射法将外源质粒pEGFP-N1导入鸡胚的研究[J]. 孙研研,蒋斌,郑江霞,徐桂云,曲鲁江,杨宁. 农业生物技术学报. 2010(04)
[9]JAK2结构及其功能研究进展[J]. 张巍,陈品林,杜丽,王凤阳,祁超. 海南大学学报(自然科学版). 2009(01)
[10]体内外精原干细胞介导大群生产转基因鸡[J]. 李碧春,孙国波,孙怀昌,徐琪,高波,周冠月,赵文明,吴信生,包文斌,余飞,陈国宏. 中国科学（C辑:生命科学）. 2008(07)
博士论文
[1]浙江省主要鸡种肉品质分析及Leptin receptor基因对鸡脂肪代谢影响分子机制的研究[D]. 黄爱霞.浙江大学 2011
[2]鹅脂肪性状相关基因的克隆表达及LEPR在脂肪细胞中的功能研究[D]. 王芳.浙江大学 2011
[3]CPT1基因对猪脂肪沉积的影响及其调控机制的研究[D]. 张艳芳.浙江大学 2010
本文编号：3185543
【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
缩略词表
前言
第一章 文献综述
1.Leptin及其受体基因的发现及相关研究
1.1 Leptin基因的发现
1.2 Leptin受体基因的发现
1.3 Leptin及其受体分子调控通路研究
1.3.1 Leptin及其受体介导的的JAK/STAT信号通路研究进展
1.3.2 Leptin及其受体介导的SOCS3信号通路研究进展
1.3.3 Leptin及其受体介导的AMPK信号转导途径
1.3.4 Leptin主要代谢通路研究小结
1.4 Leptin及其受体的生物学功能研究相关进展
1.4.1 Leptin及其受体与生长发育
1.4.2 Leptin对生殖相关激素的影响
1.4.3 Leptin与青春期启动的关联
1.4.4 Leptin对妊娠的调控作用
1.4.5 Leptin与免疫之间的关系
1.4.6 Leptin及其受体其它生物学功能小结
2.家禽Leptin及受体相关研究进展
2.1 家禽Leptin基因研究与争议
2.1.1 家禽Leptin争议的由来
2.1.2 外源Leptin对家禽的影响
2.2 家禽Leptin受体基因功能研究
2.3 家禽Leptin及其受体研究综述小结
3.转基因鸡研究进展
3.1 转基因鸡制备技术进展
3.1.1 显微注射法
3.1.2 逆转录病毒载体法
3.1.3 胚胎干细胞法
3.1.4 原生殖细胞(PGCs)转染法
3.1.5 雄性生殖细胞载体法
3.2 RNAi技术在转基因家禽上的应用
3.2.1 RNAi技术同转基因技术的结合过程
3.2.2 RNAi技术应用于转基因家禽
第二章 鸡Leptin序列克隆的验证及LEPR组织表达谱分析
1.材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 实验主要仪器
1.1.3 主要试剂及配方
1.2 实验方法
1.2.1 基因组DNA提取
1.2.2 组织RNA提取
1.2.3 PCR引物设计
1.2.4 PCR扩增程序
1.2.5 PCR引物设计与扩增
1.2.6 实时定量PCR数据分析
2.结果与分析
2.1 DNA及组织RNA提取结果
2.2 Leptin基因PCR扩增结果
2.3 LEPR荧光定量结果
3.讨论
3.1 鸡Leptin基因存在的争议
3.2 鸡LEPR基因的组织表达谱分析
第三章 RNAi验证LEPR在鸡前脂肪细胞中的功能及代谢通路变化
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 实验仪器
1.1.3 主要试剂、抗体及配方
1.2 实验方法
1.2.1 细胞的分离与培养
1.2.2 细胞的冻存复苏
1.2.3 shRNA干扰片段设计
1.2.4 载体PLLU2G-shLEPR的构建
1.2.5 质粒提取
1.2.6 脂质体转染鸡前脂肪细胞
1.2.7 细胞RNA的提取、反转录
1.2.8 荧光定量PCR分析
1.2.9 鸡前脂肪细胞的诱导分化
2.结果与分析
2.1 鸡前体脂肪细胞培养结果
2.2 RNAi质粒载体的构建
2.2.1 用XhoⅠ和HpaⅠ酶切PLLU2G骨架载体
2.2.2 菌落PCR鉴定PLLU2G-shLEPR图谱
2.2.3 载体测序结果
2.3 shLEPR质粒转染鸡前脂肪细胞的荧光检测结果
2.4 质粒干扰效率检测
2.4.1 转染后细胞RNA提取结果
2.4.2 反转录后内参基因检测
2.4.3 待测基因的PCR扩增结果琼脂糖凝胶电泳检测
2.4.4 荧光定量溶解曲线检测
2.4.5 荧光定量PCR的干扰效率检测结果
2.5 RNAi处理后各基因表达量分析
2.5.1 RNAi处理后基因表达量初步统计
2.5.2 RNAi处理基因表达量分析
2.6 RNAi处理后对细胞增殖速度的影响
3.讨论
3.1 鸡前脂肪细胞培养与诱导分化
3.1.1 鸡前脂肪细胞培养及诱导分化体系的建立
3.1.2 不同shLEPR组别细胞增殖结果
3.2 RNAi干扰后各基因表达量变化
3.2.1 shLERR干扰效率分析
3.2.2 shLEPR干扰后相关基因表达分析
3.3 shLEPR干扰前脂肪细胞研究小结
第四章 不同饲养条件下LEPR及其代谢通路基因表达变化分析
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 实验仪器
1.1.3 实验试剂及配置
1.2 实验方法
1.2.1 实验用鸡的饲养分组与饲养方式
1.2.2 组织RNA的提取及反转录
1.2.3 荧光定量检测基因表达量
2.结果与分析
2.1 体重测定结果
2.2 禁食及正常饲喂组荧光定量差异分析实验结果
2.2.1 荧光定量数据
2.2.2 各基因表达柱状图分析
3.讨论
3.1 禁食3天对体重增加的调整
3.2 禁食及正常饲喂组荧光定量差异分析
3.2.1 STAT3和NPY基因表达变化
3.2.2 AdipoR2基因和CPT-1基因表达变化
3.2.3 LEPR基因表达变化综合分析
3.3 禁食对LEPR等基因影响研究小结
第五章 shLEPR转基因鸡的构建及相关检测
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物
1.1.2 实验仪器
1.1.3 实验试剂及配置
1.2 实验方法
1.2.1 shLEPR转染用种蛋的处理
1.2.2 转基因个体绿色荧光蛋白观测
1.2.3 转基因个体基因组PCR检测
1.2.4 转基因个体Western-blot鉴定
1.2.5 转基因个体体重、体尺测量及相关器官重量测量
1.2.6 转基因个体相关基因表达量检测
2.结果及分析
2.1 shLEPR转基因测定
2.1.1 孵化率统计
2.1.2 荧光信号检测
2.1.3 转基因结果分子检测
2.2 shLEPR转基因结果分析
2.2.1 转基因个体表型性状结果与分析
2.2.2 转基因个体相关通路基因表达变化
3.讨论
3.1 shLEPR转基因效果讨论
3.1.1 胚盘下腔注射效果分析
3.1.2 转基因结果检测与分析
3.2 LEPR干扰后个体表型及基因通路变化分析
3.2.1 LEPR基因表达及表型分析
3.2.2 相关基因表达量分析
3.3 shLEPR转基因讨论小结
全文结论及创新点
全文结论
创新点
参考文献
附表
附表1 干扰质粒载体测序结果
作者简介
致谢
导师评阅表
【参考文献】：
期刊论文
[1]转基因鸡生产技术研究进展[J]. 王鹤,王彦彬,康相涛. 河南农业科学. 2012(05)
[2]甲状腺素和葡萄糖对鸡前脂肪细胞增殖和THRSPα基因表达的影响[J]. 闫文龙,朱晓彤,王荣梅,C.d’André Hirwa,杨关福,张细权. 华北农学报. 2011(04)
[3]STAT5b基因的遗传多态性及其与京海黄鸡体重和繁殖性状的关联分析[J]. 赵秀华,王金玉,张跟喜,金崇富,顾玉萍,俞亚波,施会强. 畜牧与兽医. 2011(08)
[4]Leptin介导的JAK/STAT信号通路对脂类代谢调节的研究进展[J]. 王文正,赵素梅,高士争. 中国细胞生物学学报. 2011(05)
[5]Leptin介导的SOCS3信号通路研究进展[J]. 冷俊楠,赵素梅,高士争. 云南农业大学学报(自然科学版). 2011(03)
[6]鸡脂肪细胞分化调控的研究进展[J]. 商周春,王宇祥,郭琳,王宁,李辉. 黑龙江畜牧兽医. 2011(03)
[7]鸡胚电转染-RNA干扰技术在体模型的建立[J]. 陈大为,李瑞国,刘佳利. 中国实验动物学报. 2010(05)
[8]胚盘下腔注射法将外源质粒pEGFP-N1导入鸡胚的研究[J]. 孙研研,蒋斌,郑江霞,徐桂云,曲鲁江,杨宁. 农业生物技术学报. 2010(04)
[9]JAK2结构及其功能研究进展[J]. 张巍,陈品林,杜丽,王凤阳,祁超. 海南大学学报(自然科学版). 2009(01)
[10]体内外精原干细胞介导大群生产转基因鸡[J]. 李碧春,孙国波,孙怀昌,徐琪,高波,周冠月,赵文明,吴信生,包文斌,余飞,陈国宏. 中国科学（C辑:生命科学）. 2008(07)
博士论文
[1]浙江省主要鸡种肉品质分析及Leptin receptor基因对鸡脂肪代谢影响分子机制的研究[D]. 黄爱霞.浙江大学 2011
[2]鹅脂肪性状相关基因的克隆表达及LEPR在脂肪细胞中的功能研究[D]. 王芳.浙江大学 2011
[3]CPT1基因对猪脂肪沉积的影响及其调控机制的研究[D]. 张艳芳.浙江大学 2010
本文编号：3185543
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