猪圆环病毒2型Cap基因工程疫苗的研制

发布时间：2021-05-16 01:33

　　猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2,PCV2）近年来在我国呈高发态势，给我养猪业造成了严重的经济损失。PCV2主要入侵淋巴系统引起免疫抑制，临床上多为隐性感染，常常并发或继发其他病毒或细菌病。目前，有关PCV2的疫苗的研究国内外多有报道。商品化疫苗仍以灭活疫苗为主，当前PCV2的灭活疫苗和弱毒活疫苗在抗原制备、抗体滴度、安全性等方面仍存在一定的不足，PCV2亚单位疫苗和重组疫苗因其安全性、经济性和良好的免疫诱导效果成为近年来成为研究热点。本研究首先开展我国猪圆环病毒的流行状况研究，10个省市300个样品的检测结果显示，PCV2的阳性率平均为85%（65%～92%），这一结果表明我国猪群PCV2的感染非常普遍。进一步开展分子流行病学研究发现，我国近年来流行的主要毒株基本为PCV2b亚型。本研究检测的28株毒株中，属于PCV2b亚型的有27株，占96.4%，属于PCV2a的有1株，占3.6%。同源进化分析显示，毒株之间同源性为97.6%～100%，与参考毒株的同源性为88.3%～100%。鉴于此，本研究以分离的2b亚型毒株PCV2-SL13为参考毒株，采用真核... 

【文章来源】：山东农业大学山东省

【文章页数】：56 页

【学位级别】：硕士

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符号说明
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 猪圆环病毒病简介
        1.1.1 病原学特性
            1.1.1.1 病原分类
            1.1.1.2 理化特性
            1.1.1.3 基因型
            1.1.1.4 病毒基因组结构和功能
        1.1.2 流行病学
            1.1.2.1 传染源
            1.1.2.2 传播途径
            1.1.2.3 感染机制
    1.2 PCV2 疫苗研究进展
        1.2.1 弱毒苗
        1.2.2 灭活疫苗
        1.2.3 亚单位疫苗
        1.2.4 活载体疫苗
        1.2.5 核酸疫苗
    1.3 研究目的和意义
2 我国部分省市 PCV2 的分子流行病学研究
    2.1 材料
        2.1.1 病料
        2.1.2 菌种、质粒
        2.1.3 主要试剂、试剂盒
        2.1.4 主要仪器设备
    2.2 方法
        2.2.1 病料的处理
        2.2.2 引物的设计
        2.2.3 模板的制备
        2.2.4 PCV2 样品的 PCR 扩增
        2.2.5 PCV2 全基因的扩增
        2.2.6 PCR 产物回收
        2.2.7 连接
        2.2.8 转化
            2.2.8.1 感受态细胞的制备 ( CaCl_2 法)
            2.2.8.2 转化
        2.2.9 阳性重组质粒的筛选及鉴定
            2.2.9.1 重组质粒的提取
            2.2.9.2 阳性重组质粒的鉴定
        2.2.10 PCV2 分子遗传和变异分析
    2.3 结果
        2.3.1 PCV2 Cap 基因 PCR 扩增结果
        2.3.2 PCV2 的感染和流行状况分析
        2.3.3 PCV2 全基因组的扩增结果
        2.3.4 PCV2 全基因组的分子遗传和变异分析
    2.4 讨论和分析
3 pcDNA4/HisMax-Cap 真核表达质粒的构建和免疫效力的研究
    3.1 材料
        3.1.1 毒种、质粒、实验动物
        3.1.2 主要试剂、试剂盒
        3.1.3 主要仪器设备
    3.2 方法
        3.2.1 目的基因（PCV2 ORF2）的扩增
        3.2.2 PCR 产物的回收
        3.2.3 PCR 产物与 pMD18-T 载体的连接和转化
        3.2.4 pMD-Cap 和 pcDNA4/HisMax 的双酶切
        3.2.5 Cap 基因与 pcDNA4/HisMax 的连接
        3.2.6 pcDNA4.0-Cap 重组质粒在动物体内免疫效力的测定
            3.2.6.1 重组质粒的制备
            3.2.6.2 重组质粒免疫小鼠
            3.2.6.3 被免小鼠血清中 PCV2 抗体检测
    3.3 结果
        3.3.1 猪圆环病毒 Cap 基因 PCR 扩增结果
        3.3.2 PCV2 阳性重组质粒的筛选及鉴定
        3.3.3 pMD-Cap 和 pcDNA4/HisMax 的双酶切
        3.3.4 Cap 基因与载体 pcDNA4/HisMax 的连接
        3.3.5 动物试验结果
    3.4 讨论和分析
4 PCV2-cap-腺病毒载体构建
    4.1 材料
        4.1.1 细胞、质粒
        4.1.2 主要试剂、试剂盒
        4.1.3 主要仪器设备
    4.2 方法
        4.2.1 目的基因（PCV2-Cap）的扩增
        4.2.2 PCR 产物的回收
        4.2.3 PCR 产物和空载体质粒 pacAd5CMVK-NpA Shuttle vector 的双酶切
        4.2.4 Cap 基因与 pacAd5CMVK-NpA Shuttle vector 的连接
        4.2.5 pShuttle-Cap 与腺病毒骨架载体的线性化
        4.2.6 pShuttle-Cap 与腺病毒骨架载体的共转染
        4.2.7 重组病毒的收获
        4.2.8 重组病毒的纯化
        4.2.9 重组病毒 TCID_50 测定
    4.3 结果
        4.3.1 猪圆环病毒 Cap 基因 PCR 扩增结果
        4.3.2 Cap 基因和空载体质粒腺病毒穿梭载体的双酶切
        4.3.3 猪圆环病毒 Cap 基因-腺病毒穿梭载体重组质粒的筛选及鉴定
        4.3.4 pShuttle-Cap 与腺病毒骨架载体的共转染
    4.4 讨论和分析
5 结论
参考文献
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]猪生殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒2型共感染对猪外周血天然免疫细胞含量的影响[J]. 施开创,杨汉春,郭鑫,李焕荣,盖新娜,陈艳红,查振林.  中国兽医科学. 2007(01)
[2]PCV2感染对猪MCP-1和IL-8 mRNA表达的影响[J]. 周双海,杨汉春,郭鑫,司兴奎,赵东升.  中国兽医科学. 2006(06)
[3]猪圆环病毒Ⅱ型Cap蛋白重组腺病毒的构建与鉴定[J]. 王先炜,姜平,李玉峰,蒋文明,汤景元.  Virologica Sinica. 2006(01)
[4]猪2型圆环病毒核酸疫苗免疫效应研究[J]. 宋云峰,肖少波,金梅林,张松林,陈焕春.  畜牧兽医学报. 2005(10)
[5]猪2型圆环病毒核酸疫苗的接种Balb/c小鼠实验免疫研究[J]. 金宁一,秦晓冰,郑敏,鲁会军,张洪勇,尹革芬,葛淑敏.  中国生物工程杂志. 2005(07)
[6]猪2型圆环病毒ORF1与ORF2基因和伪狂犬病毒基因的重组与表达的研究[J]. 琚春梅,陈焕春,樊惠英,刘正飞,曹胜波.  生物工程学报. 2005(03)



本文编号：3188708