新疆军垦美利奴绵羊磷脂酶C zeta基因真核表达载体的构建及其表达产物功能的研究

发布时间：2021-05-16 20:19

　　目的：中国美利奴绵羊是我国新疆特有的兼肉用与毛用于一体的绵羊品种之一，它的屠宰与使用量也是非常大。然而，对美利奴绵羊安全和可重复的生产胚胎的技术研究不是很多，因此如何提高美利奴绵羊的胚胎生产率便是当下待解决的问题之一。目前多使用蛋白激酶抑制剂或离子霉素来人工激活卵母细胞，其缺点是不清楚它特异性的激活或抑制了某种酶的生物活性，或某种特定蛋白质的合成。这种方式对我们研究激活卵母细胞卵裂的机理，或是对卵母细胞激活后的发育因素都是我们无法不确定的。因此，需要一种全新的激活卵母细胞的生物制剂，它既不使用蛋白的合成抑制剂又不使用蛋白磷酸化抑制剂，仅通过单一增加胞质内Ca2+浓度这一决定性因素来激活卵母细胞。它的获得不仅能阐明美利奴绵羊卵母细胞激活的机制也能为将来生产优质的囊胚提供帮助。本实验为国内首次在绵羊上探究磷脂酶C zeta （PLCζ）真核表达载体是否可以作为一种新的卵母细胞激活物质。方法：（1）将扩增后的基因克隆至PMD-19的T载体上，构建了PLCζ克隆载体，然后使用EcoRΙ和BamHΙ双酶切后，将PLCζ基因与原核表达载体pCzn1以及pEGFP-N1真核表达载体连接；（2）将构建... 

【文章来源】：石河子大学新疆维吾尔自治区 211工程院校

【文章页数】：53 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩写词表
前言
第一章 文献综述
    1 磷脂酶 C 的研究进展
        1.1 磷脂酶 C 发现
        1.2 磷脂酶 C 的分类
    2 精子因子假说
    3 PEGFP-N1 载体
    4 卵母细胞的激活方法
        4.1 物理激活
        4.2 化学激活
        4.3 联合激活
    5 PLCΖ的特异之处
        5.1 EF 结构域具有较高的 CA2+敏感性
        5.2 PLCΖ的 C2 区域对 CA2+振荡有重要作用
        5.3 PLCΖ的 XY 连接结构具有靶向定位作用
        5.4 精子 PLCΖ的缺陷与雄性不育
    6 研究目的及意义
第二章 实验内容
    试验一 美利奴绵羊磷脂酶 C ZETA 基因真核表达载体的构建及其表达研究
        摘要
        2.1 材料
            2.1.1 组织样品
            2.1.2 试剂、质粒及细胞
        2.2 方法
            2.2.1 PLCζ基因的扩增
            2.2.2 目的基因的回收
            2.2.3 pEGFP-N1-PLCζ重组质粒构建
            2.2.4 重组表达质粒的酶切鉴定
            2.2.5 转染及重组质粒的制备
            2.2.6 pEGFP-N1-PLCζ在 293T 细胞中的表达及定位
            2.2.7 pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达
        2.3 结果
            2.3.1 绵羊 PLCζ目的基因的扩增
            2.3.2 重组表达质粒 pEGFP-N1-PLCζ的鉴定
            2.3.3 转染后报告基因的检测
            2.3.4 293T 细胞中融合蛋白 PLCζ-EGFP 的定位观察结果
            2.3.5 重组表达质粒 pEGFP-N1-PLCζ转染绵羊胎儿成纤维细胞
            2.3.6 阳性细胞的鉴定
        2.4 讨论
        2.5 小结
    试验二 美利奴绵羊 PLCΖ基因的原核表达载体的构建与表达
        摘要
        3.1 材料
            3.1.1 菌株、质粒和试剂
            3.1.2 主要仪器设备
        3.2 方法
            3.2.1 PLCζ基因的扩增
            3.2.2 目的基因的回收
            3.2.3 pCzn1-PLCζ重组质粒构建
            3.2.4 pET-28a-PLCζ重组质粒构建
            3.2.5 菌液 PCR 鉴定目的基因重组质粒
            3.2.6 PLCζ重组质粒的酶切鉴定
            3.2.7 目的基因的原核表达
            3.2.8 目的蛋白的纯化
            3.2.9 Western-Blot 分析
        3.3 结果
            3.3.1 目的基因的扩增
            3.3.2 重组表达质粒的鉴定
            3.3.3 原核产物的表达
            3.3.4 融合蛋白的纯化和 WB 分析
        3.4 讨论
        3.5 小结
    试验三 美利奴绵羊 PLCΖ重组质粒对卵母细胞激活的初步研究
        摘要
        4.1 材料
            4.1.1 质粒、细胞
            4.1.2 主要试剂
            4.1.3 主要试剂配制
        4.2 方法
            4.2.1 重组质粒的制备
            4.2.2 显微注射针及持卵针的制作
            4.2.3 PBS 缓冲液（Phosphate Buffered Saline）和细胞培养液 DMEM 的制备
            4.2.4 卵母细胞的准备
            4.2.5 卵母细胞内质粒的注射
            4.2.6 绵羊卵母细胞的孤雌激活及体外培养
        4.3 结果
            4.3.1 卵母细胞的体外培养
            4.3.2 卵母细胞胞质内质粒的显微注射
        4.4 讨论
        4.5 小结
全文总结
创新点
参考文献
致谢
作者简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]p21-EGFP融合基因表达载体与卵母细胞的表达定位[J]. 武迪迪,张杰,具英花,宗志宏,李雪松,于秉治.  贵阳医学院学报. 2007(01)
[2]绵羊精子提取物对卵母细胞的孤雌激活作用[J]. 赛务加甫,张立,彭新荣,郭志林,杨丽,李向臣,何宽军,安志兴,张涌.  西北农林科技大学学报(自然科学版). 2006(07)
[3]蛋白质合成抑制剂亚胺环己酮（CHX）对猪卵母细胞体外成熟的影响[J]. 李光鹏,孟庆刚,魏鹏,于元松,常仲乐,谭景和.  动物学报. 2001(06)



本文编号：3190335