利用酵母双杂交系统筛选与人RIPK1互作的牛分枝杆菌蛋白

发布时间：2021-05-17 11:44

　　为探索牛分枝杆菌通过RIPK1来调节细胞凋亡的作用机制,本试验利用分子克隆技术构建诱饵质粒pGBKT7-RIPK1,并通过PEG/LiAc转化法将该质粒转入酵母菌中,经Western blot验证RIPK1在酵母菌中的表达情况后,使用该重组酵母菌筛选牛分枝杆菌基因组文库;筛选所得阳性克隆经互补验证、测序分析以及免疫共沉淀法,最终确定可与RIPK1互相作用的牛分枝杆菌蛋白。结果表明,成功构建诱饵质粒pGBKT7-RIPK1,该诱饵质粒可在酵母菌中表达RIPK1蛋白;用该酵母菌筛选牛分枝杆菌基因组文库共获得16个阳性克隆;这些阳性克隆经互补验证、测序和BLAST对比后共发现翻译正确的7个牛分枝杆菌蛋白;分别构建RIPK1和牛分枝杆菌候选蛋白的真核表达载体,经免疫共沉淀验证后发现可与RIPK1互作的3个牛分枝杆菌蛋白,分别为Mb0869c、Mb0383c和Mb2314,本研究为进一步研究牛分枝杆菌通过RIPK1调节细胞凋亡的作用机制提供数据支持。 

【文章来源】：中国兽医学报. 2020,40(09)北大核心CSCD

【文章页数】：7 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 菌株、质粒及细胞株
    1.2 主要试剂
    1.3 人RIPK1基因的扩增
    1.4 诱饵质粒pGBKT7-RIPK1的构建
    1.5 重组酵母菌的构建
    1.6 筛选与RIPK1互作的牛分枝杆菌蛋白
    1.7 阳性克隆的互补验证及测序
    1.8 免疫共沉淀法验证蛋白的互相作用
        1.8.1 真核表达载体的构建
        1.8.2 免疫共沉淀法
2 结果
    2.1 构建含有RIPK1基因的诱饵质粒
    2.2 诱饵蛋白RIP1在酵母菌中的表达情况
    2.3 筛选牛分枝杆菌基因组文库
    2.4 回补验证阳性克隆
    2.5 真核表达载体的构建
    2.6 免疫沉淀法验证分枝杆菌候选蛋白与RIPK1互作情况
3 讨 论



本文编号：3191705