C2C12成肌分化过程中SKIP与PI3K/Akt和p38信号通路之间关系的研究

发布时间：2021-05-21 06:17

　　骨骼肌纤维是骨骼肌的主要组成部分,而肌纤维的数目由出生前肌源细胞的成肌分化进程所决定,直接影响家畜的生长潜能和肉质。MyoD依赖的肌肉特异性基因的染色质重塑激活是控制成肌分化的重要方式,受PI3K/Akt和p38信号通路共同调控;SKIP（Skeletal muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase）在成肌分化过程中上调表达,并负调控成肌分化。本课题旨在探究C2C12成肌分化过程中SKIP与PI3K/Akt和p38信号通路之间的关系。主要研究结果如下:1)2%马血清诱导C2C12成肌分化,通过荧光定量PCR以及蛋白质免疫印迹检测SKIP的表达、亚硫酸氢盐方法检测成肌分化前后SKIP调控区DNA甲基化状态、ATAC-seq技术检测成肌分化前后SKIP的染色质开放状态、ChIP检测成肌分化前后转录因子MyoD以及甲基化组蛋白H3K27me3与SKIP启动子的结合情况。结果表明:SKIP的mRNA水平以及蛋白水平均在成肌分化中上调表达;相比成肌分化前,成肌分化后SKIP调控区DNA甲基化的分布发生改变,程度无明显差异;在成肌分化前,SKIP... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
    1 前言
    2 SKIP研究进展
        2.1 SKIP在胰岛素信号中的研究
        2.2 SKIP在成肌分化中的研究
        2.3 SKIP在肌纤维发育中的研究
    3 PI3K/Akt信号通路
    4 p38丝裂原活化蛋白激酶通路
    5 MyoD与 PI3K/Akt和 p38 信号通路
    6 研究目的与意义
第二章 材料和方法
    1 试验材料
        1.1 载体和细胞系
        1.2 主要仪器和设备
        1.3 主要试剂
        1.4 主要溶液的配制
            1.4.1 琼脂糖凝胶电泳检测所需溶液配制
            1.4.2 细胞培养所需溶液的配制
            1.4.3 抑制剂工作液的配制
            1.4.4 Western blot试剂
    2 试验方法
        2.1 PCR产物的检测与鉴定
            2.1.1 连接克隆载体
            2.1.2 DH5α感受态大肠杆菌快速转化
            2.1.3 扩大培养和菌液PCR检测
        2.2 腺病毒感染细胞
        2.3 细胞培养
            2.3.1 细胞复苏
            2.3.2 细胞培养和传代
            2.3.3 细胞冻存
        2.4 细胞免疫荧光(6孔板)
        2.5 荧光定量PCR分析
            2.5.1 总RNA的提取
            2.5.2 RNA浓度测定和质量检测
            2.5.3 反转录c DNA的合成
            2.5.4 cDNA质量检测
            2.5.5 实时定量PCR引物设计
            2.5.6 实时荧光定量法对基因的验证
        2.6 Western Blot试验方法
            2.6.1 细胞总蛋白的提取
            2.6.2 蛋白浓度测定
            2.6.3 蛋白变性
            2.6.4 Western Blot具体步骤
        2.7 ChIP
        2.8 甲基化分析模板的处理
        2.9 生物学工具
        2.10 统计学分析
第三章 结果与分析
    第一部分 成肌分化对SKIP表达的影响
        1 成肌分化过程中SKIP的表达改变
        2 成肌细胞分化前后SKIP调控区DNA甲基化状态
        3 成肌分化前后SKIP的染色质开放状态
        4 成肌细胞分化前后转录因子MyoD及甲基化的组蛋白(H3K27me3)与SKIP启动子的结合情况
    第二部分 PI3K和 p38 信号通路对成肌分化过程中SKIP表达调控的影响
        1 p-AKT、p-p38 信号对成肌分化的影响
        2 p-AKT、p-p38 信号对SKIP表达的影响
        3 p-AKT信号通过介导MyoD与 SKIP启动子的结合影响SKIP的表达
    第三部分 超表达山羊SKIP基因对成肌分化的影响
        1 腺病毒合适MOI的确定以及SKIP超表达效果的检测
        2 成肌分化不同阶段SKIP超表达效果分析
        3 超表达SKIP对成肌分化标志基因表达的影响
        4 超表达SKIP对成肌分化关键信号蛋白p-AKT、p-p38 表达的影响
第四章 讨论
    1 SKIP与 MyoD结合介导染色质重塑
    2 成肌分化过程中SKIP与 PI3K/Akt和 p38 信号通路之间的相互关系
    3 C2C12成肌分化过程中SKIP反馈调节PI3K/Akt、p38信号通路
第五章 小结
    1 主要结论
    2 本研究创新之处
    3 本研究的不足之处
    4 下一步工作计划
参考文献
研究生在读期间发表的论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[3]P38MAPK信号通路在滋养细胞侵袭能力中的调控机制[J]. 陶跃平,钟少平,葛加美.  武汉轻工大学学报. 2019(01)
[4]p38 MAPK通路调控BMP9诱导hPDLSCs成骨分化的体外研究[J]. 张奕,胡婷,叶国,向学熔,胡娜.  上海口腔医学. 2018(06)
[5]p38-MAPK和STAT3信号分子靶点对微氧化应激下牙髓干细胞增殖、分化的影响[J]. 胡红梅,廖家万,李伟,曾常爱.  实用口腔医学杂志. 2018(06)
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[7]p38信号通路对缺氧下大鼠星形胶质细胞增殖凋亡的影响及机制研究[J]. 邵广田,陈霄雷,邵璐斐.  临床和实验医学杂志. 2017(13)
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[9]MyoD介导肌肉特异性基因染色质重塑激活与成肌分化控制[J]. 熊琪,李晓锋,索效军,张年,刘洋,陈明新.  湖北农业科学. 2014(20)
[10]PI3K/Akt信号通路在骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化调控中的作用[J]. 王雪鹏,李茂强,边振宇,季成,何齐芳,姚旺祥,朱六龙.  中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志. 2014(03)

博士论文
[1]猪SKIP和SHIP2基因的克隆、遗传效应及功能初步研究[D]. 熊琪.华中农业大学 2010
[2]PI3K-Akt-mTOR信号通路参与调控细胞分化[D]. 孟艳.中国协和医科大学 2008
[3]Myostatin负调控成肌细胞增殖和分化的信号转导机制研究[D]. 黄志清.四川农业大学 2008
[4]猪骨骼肌形成过程中的几种决定因子（MDF）的遗传效应及其遗传多态性和分子进化研究[D]. 朱砺.四川农业大学 2004

硕士论文
[1]Egr1对小鼠成肌细胞C2C12分化的影响[D]. 崔亚凤.东北农业大学 2018
[2]KLC1通过调控AKT的激活来促进成肌细胞分化[D]. 张广安.浙江大学 2018
[3]C2C12细胞成肌分化过程中CaMKⅡ对MEF2C的调控作用及对分化的影响[D]. 潘伟.内蒙古大学 2016
[4]TMEM8C、CTRP3基因对C2C12细胞成肌分化的调控作用研究[D]. 赵元元.华中农业大学 2014
[5]Mef2C通过脂联素受体1信号途径调控成肌细胞分化[D]. 郑宇.华中农业大学 2013
[6]利用单根肌纤维法分离和培养猪骨骼肌卫星细胞及其成肌诱导分化研究[D]. 刘月光.西北农林科技大学 2011



本文编号：3199204