糖酵解在弓形虫生长发育中的生物学作用
发布时间：2021-05-21 11:15
弓形虫是一种专性细胞内寄生的顶复门原虫,是非常重要的人兽共患病原体,感染全球三分之一以上的人口和难以计数的野生动物与家畜,造成严重的社会问题和巨大的经济损失。弓形虫生活史复杂,在中间宿主体内有速殖子和缓殖子两种形式,对应急性和慢性感染,这二者之间能够相互转化且这种转化是弓形虫传播和致病的关键因素。阐明速殖子和缓殖子时期虫体的生长代谢规律对理解其生活史和设计药物与疫苗非常重要。速殖子和缓殖子存在明显的代谢活动差异,绝大多数糖酵解酶在虫体中有两个亚型,且每一对中两个亚型的表达在速殖子与缓殖子期呈显著差异。此外,当前的模型认为,弓形虫速殖子有很好的代谢灵活性,葡萄糖作为碳源的代谢可以被谷氨酰胺取代而不明显影响虫体生长。那么糖酵解在虫体生长发育中到底有什么作用?带着这个问题,本研究选取糖酵解中的乳酸脱氢酶（LDH）和丙酮酸激酶（PYK）为研究对象,采用遗传学、代谢组学和生物化学等方法研究它们在虫体生长发育中的生物学作用,具体包括:（1）乳酸发酵对体内弓形虫生长的关键作用及机制弓形虫表达两个乳酸脱氢酶,我们对速殖子期特异性表达的LDH1和缓殖子期特异性表达的LDH2进行单独或者联合敲除,结果表明...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：142 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 弓形虫是非常重要的人畜共患病原体
1.1.1 弓形虫及其危害
1.1.2 弓形虫速殖子与缓殖子
1.1.3 弓形虫基因型与毒力
1.2 弓形虫疫苗
1.2.1 弓形虫灭活疫苗和亚单位疫苗
1.2.2 弓形虫减毒活疫苗
1.3 弓形虫感染与宿主免疫反应
1.4 弓形虫表现代谢灵活多样性
1.4.1 弓形虫的糖代谢途径
1.4.2 糖代谢途径的生物学意义尚存争议
1.4.3 弓形虫的脂代谢途径
1.4.4 糖酵解酶在弓形虫脂代谢途径中的作用与生物学意义尚不明了
1.5 弓形虫CRISPR-Cas9基因编辑和四环素(ATC)调控系统
1.6 尚待解决的科学问题
第二章 乳酸脱氢酶对弓形虫生长发育的作用与机制研究
2.1 研究目的与意义
2.2 实验材料
2.2.1 实验动物
2.2.2 引物与质粒
2.2.3 实验菌株、细胞和虫株
2.2.4 主要仪器与试剂
2.2.5 主要溶液与试剂的配制
2.3 实验方法
2.3.1 弓形虫的培养、收集与纯化
2.3.2 弓形虫基因组g DNA的提取
2.3.3 弓形虫RNA的提取
2.3.4 弓形虫cDNA的制备
2.3.5 PCR扩增目的片段
2.3.6 目的片段回收
2.3.7 同源重组质粒构建
2.3.8 CRISPR质粒构建
2.3.9 大肠杆菌化学感受态细胞的制备
2.3.10 连接产物转化
2.3.11 HFF细胞及弓形虫的复苏
2.3.12 HFF细胞的传代培养
2.3.13 HFF细胞及弓形虫的冻存
2.3.14 敲除株及回补虫株的构建及鉴定
2.3.15 空斑实验
2.3.16 弓形虫速殖子复制实验
2.3.17 缓殖子转化率实验
2.3.18 弓形虫缓殖子复制实验
2.3.19 毒力实验
2.3.20 ELASE检测小鼠血清
2.3.21小鼠体内荷虫量实验
2.3.22 荧光定量PCR(qPCR)实验
2.3.23 弓形虫脑包囊形成实验
2.3.24 GC/LC-MS进行代谢分析
2.3.25 寡霉素A敏感性试验
2.3.26 统计分析
2.4 结果与分析
2.4.1 在体外标准培养条件下,LDH对弓形虫的生长不重要
2.4.2 LDH1缺失导致弓形虫毒力减弱和脑包囊数量减少
2.4.3 回补LDH1恢复弓形虫毒力和缓殖子形成能力
2.4.4 LDH1和LDH2的双缺失进一步降低弓形虫的毒力
2.4.5 LDH敲除阻断乳酸产生,导致糖酵解紊乱
2.4.6 LDH对弓形虫在宿主体内繁殖非常关键
2.4.7 LDH对低氧条件下弓形虫的生长非常关键
2.4.8 LDH敲除虫株对氧化磷酸化抑制剂寡霉素A高度敏感
2.5 讨论
2.6 结论
第三章 乳酸脱氢酶敲除虫株免疫保护性评估与机制研究
3.1 研究目的与意义
3.2 材料与方法
3.2.1 实验动物
3.2.2 细胞和虫株
3.2.3 脑包囊毒力实验
3.2.4 小鼠活体成像实验
3.2.5 免疫保护力实验
3.2.6 ELISA检测血清抗体
3.2.7 被动免疫实验
3.2.8 免疫小鼠脾细胞悬液的制备
3.2.9 BCA法测全虫抗原浓度
3.2.10 脾细胞培养上清细胞因子检测
3.2.11 统计分析
3.3 结果与分析
3.3.1 ME49Δldh脑包囊的毒力严重减弱
3.3.2 ME49Δldh免疫接种引起对速殖子感染的强免疫保护性
3.3.3 免疫Δldh产生对缓殖子感染的免疫保护
3.3.4 免疫接种Δldh阻断再感染组织包囊的形成
3.3.5 免疫接种Δldh能够快速清除再感染的野生型虫体
3.3.6 免疫接种Δldh显著增加细胞因子和特异性IgG抗体的水平
3.3.7 Δldh免疫接种小鼠的血清对弓形虫再感染提供部分免疫保护
3.3.8 全虫抗原刺激Δldh免疫小鼠的脾细胞产生高水平的细胞因子
3.4 讨论
3.5 结论
第四章 丙酮酸激酶对弓形虫生长及代谢的关键作用与机制研究
4.1 研究目的与意义
4.2 材料与方法
4.2.1 实验动物
4.2.2 实验菌株和细胞
4.2.3 质粒和虫株
4.2.4 主要试剂及配制
4.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳
4.2.6 Western-blot
4.2.7 入侵实验
4.2.8 ATP含量检测
4.2.9 弓形虫顶质体数量检测
4.2.10 生长缺陷和顶质体丢失可逆性检测
4.2.11 弓形虫顶质体、线粒体、细胞核g DNA检测
4.2.12 IFA-PAS染色
4.2.13 统计分析
4.3 结果与分析
4.3.1 PYK1对弓形虫生长非常重要
4.3.2 移除葡萄糖没有救援PYK1抑制导致的生长缺陷
4.3.3 抑制PYK1表达导致细胞ATP减少和相关代谢物水平改变
4.3.4 PYK1抑制影响~(13)C-葡萄糖的代谢流
4.3.5 条件性敲除PYK1导致积累大量的支链淀粉
4.3.6 乳酸和丙氨酸可以部分拯救PYK1抑制导致的生长缺陷
4.3.7 双缺失PYK1和PYK2完全阻碍弓形虫生长
4.3.8 PYK敲除造成顶质体丢失
4.4 讨论
4.5 结论
第五章 全文总结与展望
5.1 全文总结
5.2 展望
参考文献
附录一
附录二
附录三
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]用四环素诱导调控表达系统构建弓形虫脂肪酸合成酶FABZ缺陷株[J]. 吴亮,薛兰兰,王晓,吴腊梅,姜旭淦,陈盛霞. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2014(04)
[2]顶复门寄生虫顶质体的研究进展[J]. 张维,刘群. 中国兽医科学. 2006(08)
博士论文
[1]弓形虫硬脂酰辅酶A去饱和酶的鉴定及功能研究[D]. 郝攀.中国农业大学 2016
[2]TALEN和CRISPR技术在弓形虫致病机制研究中的应用[D]. 张伟超.华中农业大学 2016
[3]与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定[D]. 王一凡.华中农业大学 2015
硕士论文
[1]DnaK-TPR与LDH2基因在弓形虫生长发育中的功能与调控机制研究[D]. 张丽红.华中农业大学 2018
[2]运输应激条件下弓形虫缓殖子向速殖子转化差异蛋白的筛选及鉴定[D]. 袁园.华中农业大学 2015
[3]弓形虫速殖子与缓殖子体外相互转换模型的构建[D]. 施远香.中南大学 2014
[4]中国西南地区猫源弓形虫株基因分型及毒力研究[D]. 孟德娣.安徽医科大学 2013
[5]两株猪源刚地弓形虫的分离及其生物学特性的研究[D]. 王尚尚.扬州大学 2012
本文编号：3199607
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：142 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
1.1 弓形虫是非常重要的人畜共患病原体
1.1.1 弓形虫及其危害
1.1.2 弓形虫速殖子与缓殖子
1.1.3 弓形虫基因型与毒力
1.2 弓形虫疫苗
1.2.1 弓形虫灭活疫苗和亚单位疫苗
1.2.2 弓形虫减毒活疫苗
1.3 弓形虫感染与宿主免疫反应
1.4 弓形虫表现代谢灵活多样性
1.4.1 弓形虫的糖代谢途径
1.4.2 糖代谢途径的生物学意义尚存争议
1.4.3 弓形虫的脂代谢途径
1.4.4 糖酵解酶在弓形虫脂代谢途径中的作用与生物学意义尚不明了
1.5 弓形虫CRISPR-Cas9基因编辑和四环素(ATC)调控系统
1.6 尚待解决的科学问题
第二章 乳酸脱氢酶对弓形虫生长发育的作用与机制研究
2.1 研究目的与意义
2.2 实验材料
2.2.1 实验动物
2.2.2 引物与质粒
2.2.3 实验菌株、细胞和虫株
2.2.4 主要仪器与试剂
2.2.5 主要溶液与试剂的配制
2.3 实验方法
2.3.1 弓形虫的培养、收集与纯化
2.3.2 弓形虫基因组g DNA的提取
2.3.3 弓形虫RNA的提取
2.3.4 弓形虫cDNA的制备
2.3.5 PCR扩增目的片段
2.3.6 目的片段回收
2.3.7 同源重组质粒构建
2.3.8 CRISPR质粒构建
2.3.9 大肠杆菌化学感受态细胞的制备
2.3.10 连接产物转化
2.3.11 HFF细胞及弓形虫的复苏
2.3.12 HFF细胞的传代培养
2.3.13 HFF细胞及弓形虫的冻存
2.3.14 敲除株及回补虫株的构建及鉴定
2.3.15 空斑实验
2.3.16 弓形虫速殖子复制实验
2.3.17 缓殖子转化率实验
2.3.18 弓形虫缓殖子复制实验
2.3.19 毒力实验
2.3.20 ELASE检测小鼠血清
2.3.21小鼠体内荷虫量实验
2.3.22 荧光定量PCR(qPCR)实验
2.3.23 弓形虫脑包囊形成实验
2.3.24 GC/LC-MS进行代谢分析
2.3.25 寡霉素A敏感性试验
2.3.26 统计分析
2.4 结果与分析
2.4.1 在体外标准培养条件下,LDH对弓形虫的生长不重要
2.4.2 LDH1缺失导致弓形虫毒力减弱和脑包囊数量减少
2.4.3 回补LDH1恢复弓形虫毒力和缓殖子形成能力
2.4.4 LDH1和LDH2的双缺失进一步降低弓形虫的毒力
2.4.5 LDH敲除阻断乳酸产生,导致糖酵解紊乱
2.4.6 LDH对弓形虫在宿主体内繁殖非常关键
2.4.7 LDH对低氧条件下弓形虫的生长非常关键
2.4.8 LDH敲除虫株对氧化磷酸化抑制剂寡霉素A高度敏感
2.5 讨论
2.6 结论
第三章 乳酸脱氢酶敲除虫株免疫保护性评估与机制研究
3.1 研究目的与意义
3.2 材料与方法
3.2.1 实验动物
3.2.2 细胞和虫株
3.2.3 脑包囊毒力实验
3.2.4 小鼠活体成像实验
3.2.5 免疫保护力实验
3.2.6 ELISA检测血清抗体
3.2.7 被动免疫实验
3.2.8 免疫小鼠脾细胞悬液的制备
3.2.9 BCA法测全虫抗原浓度
3.2.10 脾细胞培养上清细胞因子检测
3.2.11 统计分析
3.3 结果与分析
3.3.1 ME49Δldh脑包囊的毒力严重减弱
3.3.2 ME49Δldh免疫接种引起对速殖子感染的强免疫保护性
3.3.3 免疫Δldh产生对缓殖子感染的免疫保护
3.3.4 免疫接种Δldh阻断再感染组织包囊的形成
3.3.5 免疫接种Δldh能够快速清除再感染的野生型虫体
3.3.6 免疫接种Δldh显著增加细胞因子和特异性IgG抗体的水平
3.3.7 Δldh免疫接种小鼠的血清对弓形虫再感染提供部分免疫保护
3.3.8 全虫抗原刺激Δldh免疫小鼠的脾细胞产生高水平的细胞因子
3.4 讨论
3.5 结论
第四章 丙酮酸激酶对弓形虫生长及代谢的关键作用与机制研究
4.1 研究目的与意义
4.2 材料与方法
4.2.1 实验动物
4.2.2 实验菌株和细胞
4.2.3 质粒和虫株
4.2.4 主要试剂及配制
4.2.5 SDS-PAGE凝胶电泳
4.2.6 Western-blot
4.2.7 入侵实验
4.2.8 ATP含量检测
4.2.9 弓形虫顶质体数量检测
4.2.10 生长缺陷和顶质体丢失可逆性检测
4.2.11 弓形虫顶质体、线粒体、细胞核g DNA检测
4.2.12 IFA-PAS染色
4.2.13 统计分析
4.3 结果与分析
4.3.1 PYK1对弓形虫生长非常重要
4.3.2 移除葡萄糖没有救援PYK1抑制导致的生长缺陷
4.3.3 抑制PYK1表达导致细胞ATP减少和相关代谢物水平改变
4.3.4 PYK1抑制影响~(13)C-葡萄糖的代谢流
4.3.5 条件性敲除PYK1导致积累大量的支链淀粉
4.3.6 乳酸和丙氨酸可以部分拯救PYK1抑制导致的生长缺陷
4.3.7 双缺失PYK1和PYK2完全阻碍弓形虫生长
4.3.8 PYK敲除造成顶质体丢失
4.4 讨论
4.5 结论
第五章 全文总结与展望
5.1 全文总结
5.2 展望
参考文献
附录一
附录二
附录三
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]用四环素诱导调控表达系统构建弓形虫脂肪酸合成酶FABZ缺陷株[J]. 吴亮,薛兰兰,王晓,吴腊梅,姜旭淦,陈盛霞. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志. 2014(04)
[2]顶复门寄生虫顶质体的研究进展[J]. 张维,刘群. 中国兽医科学. 2006(08)
博士论文
[1]弓形虫硬脂酰辅酶A去饱和酶的鉴定及功能研究[D]. 郝攀.中国农业大学 2016
[2]TALEN和CRISPR技术在弓形虫致病机制研究中的应用[D]. 张伟超.华中农业大学 2016
[3]与弓形虫微线体蛋白互作的宿主蛋白的筛选和鉴定[D]. 王一凡.华中农业大学 2015
硕士论文
[1]DnaK-TPR与LDH2基因在弓形虫生长发育中的功能与调控机制研究[D]. 张丽红.华中农业大学 2018
[2]运输应激条件下弓形虫缓殖子向速殖子转化差异蛋白的筛选及鉴定[D]. 袁园.华中农业大学 2015
[3]弓形虫速殖子与缓殖子体外相互转换模型的构建[D]. 施远香.中南大学 2014
[4]中国西南地区猫源弓形虫株基因分型及毒力研究[D]. 孟德娣.安徽医科大学 2013
[5]两株猪源刚地弓形虫的分离及其生物学特性的研究[D]. 王尚尚.扬州大学 2012
本文编号：3199607
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