4个沉默鸡Ii基因慢病毒载体的构建及其效果比较

发布时间：2021-05-22 01:08

　　恒定链（invariant chain, Ii）是脊椎动物重要的免疫分子,在MHC递呈抗原中起重要作用。但是对Ii的研究主要集中于人和小鼠,而鸡Ii的研究相对滞后。近年发展的RNA干扰技术是一种强大的基因功能研究工具,被广泛的应用于基因功能的研究和基因治疗。为研究鸡Ii与MHCⅡ类分子的关系,本实验利用RNAi技术构建了4个沉默鸡Ii的慢病毒重组载体并比较了它们的沉默效率。首先,用自行设计合成的4个鸡Ii基因干扰序列经退火形成双链shRNA片段,再将其插入慢病毒载体pLL3.7。应用PCR、酶切和测序鉴定后,将正确的重组慢病毒载体与辅助包装质粒共转染于293T细胞进行病毒的包装,待病毒收获处理后,再感染鸡源巨噬细胞HD-11,最后用荧光定量PCR检测鸡Ii mRNA的相对表达水平。测序结果显示我们正确构建了4个重组慢病毒干扰载体,它们分别被命名为pLL-Ii-shRNA236. pLL-Ii-shRNA376、pLL-Ii-shRNA527 和 pLL-Ii-shRNA539.共转染293T细胞后,培养48h能在荧光显微镜下观察到荧光表达,说明成功包装了慢病毒,分别命名为LV-shRN... 

【文章来源】：安徽农业大学安徽省

【文章页数】：58 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
本论文常用中英文缩写词
文献综述
引言
1 材料与方法
    1.1 实验材料
        1.1.1 质粒、菌株与细胞株
        1.1.2 工具酶与相关试剂
        1.1.3 主要实验用试剂配置方法
        1.1.4 主要实验仪器
    1.2 实验方法
        1.2.1 靶向鸡Ii基因shRNA序列的设计与合成
        1.2.2 互补单链退火形成双链shRNA片段
        1.2.3 慢病毒载体质粒pLL3.7的线性化
        1.2.4 重组慢病毒载体的构建
        1.2.5 阳性克隆的PCR筛选与鉴定
        1.2.6 阳性克隆的单酶切验证与测序
        1.2.7 重组慢病毒载体质粒的包装
        1.2.8 慢病毒滴度的检测
        1.2.9 荧光定量PCR检测Ii基因mRNA相对表达水平
2 结果与分析
    2.1 靶向鸡Ii基因shRNA退火后的检测
    2.2 慢病毒载体pLL3.7的双酶切结果
    2.3 重组慢病毒载体的PCR鉴定
    2.4 重组慢病毒载体的酶切鉴定
    2.5 重组慢病毒载体的测序结果
    2.6 无内毒素重组质粒的检测
    2.7 重组慢病毒的包装与滴度检测结果
    2.8 慢病毒感染HD-11细胞及其感染效率的测定
    2.9 总RNA的鉴定
    2.10 荧光定量PCR比较4个重组载体沉默鸡Ii基因的效率
3 讨论
    3.1 RNA干扰应用方式的选择
    3.2 shRNA的设计
    3.3 慢病毒的包装与保存
结论
参考文献
致谢
作者简介



本文编号：3200690