猪伪狂犬病毒gB基因主要抗原区的原核表达及其单克隆抗体的制备

发布时间：2021-05-24 02:53

　　猪伪狂犬病（Pseudorabies, PR）是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起的一种急性传染病。近年来，猪伪狂犬病的感染区域不断扩大，对世界各地的养殖业都造成了不同程度的经济损失，因此，建立有效的检测、诊断方法对控制乃至最终消灭猪伪狂犬病有着重要意义。本研究利用原核表达系统表达了PRV gB蛋白的主要抗原区；并分别以纯化的猪伪狂犬病毒（S株）和gB重组蛋白为免疫原制备单克隆抗体，最终，筛选得到6株能够稳定分泌PRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。活性检测表明，杂交瘤细胞株2D8、3G7与猪瘟病毒（HCV）、猪圆环病毒（PCV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）及正常PK-15细胞均不反应，与猪伪狂犬病毒（PRV）有良好的反应原性；制备的腹水能够与PRV特异性结合。本研究为进一步建立高效、特异、敏感的检测方法及研制基因工程抗体奠定了基础。 

【文章来源】：黑龙江大学黑龙江省

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
Abstract
符号说明
第1章 绪论
    1.1 伪狂犬病的研究进展
        1.1.1 伪狂犬病的流行病学研究
        1.1.2 猪伪狂犬病临床症状
        1.1.3 猪伪狂犬病的防治现状
    1.2 猪伪狂犬病的检测方法
        1.2.1 病毒的分离鉴定
        1.2.2 动物接种试验
        1.2.3 免疫学诊断方法
        1.2.4 分子生物学诊断方法
    1.3 猪伪狂犬病毒的研究现状
        1.3.1 猪伪狂犬病毒的结构
        1.3.2 猪伪狂犬病毒的理化特性
        1.3.3 猪伪狂犬病毒的主要糖蛋白
    1.4 单克隆抗体的研究进展
        1.4.1 单克隆抗体技术
        1.4.2 单克隆抗体的特点
        1.4.3 单克隆抗体的应用
    1.5 研究目的及意义
第2章 猪伪狂犬病毒gB蛋白抗原表位区的克隆、表达及纯化
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 菌株、载体和病毒株
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 主要仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 猪伪狂犬病毒的培养
        2.2.2 目的基因的获得及扩增
        2.2.3 重组克隆载体的构建
        2.2.4 重组表达载体的构建
        2.2.5 表达产物的鉴定
        2.2.6 重组gB蛋白的诱导表达
        2.2.7 重组gB蛋白的纯化
    2.3 试验结果与分析
        2.3.1 PRV 在鸡胚成纤维细胞的增殖
        2.3.2 增殖病毒的鉴定
        2.3.3 PRV gB 蛋白目的片段的扩增
        2.3.4 目的片段的测定与分析
        2.3.5 重组表达载体 pET-gB 的构建
        2.3.6 表达蛋白的鉴定
        2.3.7 表达蛋白诱导条件的确定
        2.3.8 表达蛋白的纯化
    2.4 本章小结
第3章 猪伪狂犬病毒单克隆抗体的制备
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 毒株、细胞与实验动物
        3.1.2 主要试剂与药品
        3.1.3 主要仪器与设备
    3.2 病毒的纯化
    3.3 动物免疫
    3.4 间接ELISA方法的建立
    3.5 SP2/0细胞的制备
    3.6 饲养层细胞的制备
    3.7 脾淋巴细胞的制备
    3.8 细胞融合
    3.9 阳性杂交瘤细胞的筛选
    3.10 阳性杂交瘤细胞的克隆
    3.11 杂交瘤细胞的冻存和复苏
    3.12 试验结果与分析
        3.12.1 间接ELISA最佳工作条件的确定
        3.12.2 单克隆抗体的筛选
    3.13 本章小结
第4章 猪伪狂犬病毒重组gB蛋白单克隆抗体的活性分析
    4.1 材料与仪器
        4.1.1 细胞与动物
        4.1.2 主要试剂与药品
        4.1.3 主要仪器与设备
    4.2 单克隆抗体亚型的鉴定
    4.3 杂交瘤细胞染色体的计数分析
    4.4 单克隆抗体特异性的鉴定
    4.5 单克隆抗体稳定性的检测
    4.6 单克隆抗体腹水的制备
    4.7 腹水效价的测定
    4.8 PRV 在 PK-15 的扩增
    4.9 猪伪狂犬病毒的鉴定
        4.9.1 猪伪狂犬病毒 DNA 的提取
        4.9.2 猪伪狂犬病毒的 PCR 鉴定
    4.10 间接免疫荧光试验
    4.11 试验结果与分析
        4.11.1 单克隆抗体的亚型鉴定
        4.11.2 杂交瘤细胞染色体的计数分析
        4.11.3 单克隆抗体特异性的鉴定
        4.11.4 单克隆抗体稳定性的检测
        4.11.5 单克隆抗体腹水效价的测定
        4.11.6 PRV 在 PK-15 的扩增
        4.11.7 猪伪狂犬病毒的鉴定
        4.11.8 间接免疫荧光试验
    4.12 本章小结
第5章 结论
    5.1 PRVgB蛋白主要抗原表位的表达
    5.2 猪伪狂犬病毒单克隆抗体的制备
参考文献
攻读硕士学位期间的学术成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3203421