Orai1对高NEFA介导的犊牛肝细胞氧化应激和内质网应激的调控作用

发布时间：2021-05-26 16:25

　　脂肪肝是围产期奶牛高发的一个重要营养代谢性疾病,降低奶牛的生产性能。由于奶牛产后干物质采食量（DMI）降低,而泌乳能量需求增加,致使奶牛机体进入能量负平衡状态,而为了满足妊娠和泌乳的能量需求而动员脂肪导致大量非酯化脂肪酸（NEFAs）进入血液,形成高NEFA血症。大量NEFA进入肝脏后酯化形成甘油三酯（TG）,进而导致脂肪肝的产生。血浆NEFA,脂肪肝和脂质过氧化之间的联系均与代谢应激有关。细胞内Ca²⁺的稳态是细胞保持正常结构和功能的前提与基础。钙池引发的钙离子进入（SOCE）是非兴奋性细胞调控其细胞内钙离子浓度Ca²⁺的主要通道。Orai1是SOCE在细胞膜上的孔蛋白。本研究团队前期发现Orai1调控围产期奶牛高NEFA引起的肝脂肪从头合成通路,进而形成脂肪肝。而Orai1是否通过代谢应激引起肝脂沉积尚不明确。因此,本研究旨在明确高NEFA在肝脂沉积过程中是如何调控氧化应激与内质网应激。本研究利用高NEFA刺激原代犊牛肝细胞构建的肝脂沉积模型进行研究。首先原代犊牛肝细胞经1.2 mM NEFA分别刺激0.5、1、3、6、9、12 h。结果... 

【文章来源】：黑龙江八一农垦大学黑龙江省

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
1 文献综述
    1.1 奶牛脂肪肝病的研究进展
        1.1.1 奶牛脂肪肝病因学
        1.1.2 奶牛脂肪肝的分类及流行病学
        1.1.3 奶牛脂肪肝病的检测
    1.2 围产期奶牛氧化应激与内质网应激的概述
        1.2.1 围产期奶牛氧化应激概述
        1.2.2 能量负平衡与内质网应激
        1.2.3 氧化应激与内质网应激的关联
    1.3 钙池引发的钙离子进入调控机体氧化应激与内质网应激的研究进展
        1.3.1 内质网中钙离子的作用
        1.3.2 钙离子与线粒体的关系
        1.3.3 钙池引发钙离子的内流
    1.4 试验的目的与意义
2 材料与方法
    2.1 试剂与仪器
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 主要试剂材料
        2.1.3 主要仪器
    2.2 原代犊牛肝细胞的分离与培养
        2.3.1 原代犊牛肝细胞的分离
        2.3.2 原代犊牛肝细胞的培养
    2.3 siRNA的合成
    2.4 NEFA的准备和细胞处理
        2.4.1 NEFA的制备
        2.4.2 肝细胞的分组与处理
    2.5 Western Blotting检测
        2.5.1 总蛋白的提取
        2.5.2 蛋白浓度测定
        2.5.3 蛋白表达的测定
    2.6 Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR)检测
        2.6.1 引物的设计与合成
        2.6.2 总RNA的提取
        2.6.3 反转录
        2.6.4 实时荧光定量PCR
    2.7 肝细胞氧化和抗氧化指标检测
    2.8 细胞ROS测定
    2.9 细胞中Ca~(2+)浓度测定
    2.10 免疫荧光分析
    2.11 线粒体钙离子释放检测(mPTP)
    2.12 线粒体膜电位检测(JC-1)
    2.13 透射电子显微镜观察线粒体形态
    2.14 统计学分析
3 结果与分析
    3.1 犊牛原代肝细胞中高NEFA介导氧化应激和内质网应激
        3.1.1 犊牛原代肝细胞中高NEFA刺激对氧化应激的影响
        3.1.2 犊牛原代肝细胞中NEFA刺激对内质网应激的影响
        3.1.3 抑制氧化应激可缓解NEFA诱导肝细胞内质网应激
    3.2 犊牛原代肝细胞中高NEFA对胞内Ca~(2+)浓度及Orai1 表达的作用
    3.3 犊牛肝细胞Orai1 调控高NEFA介导的氧化应激和内质网应激
        3.3.1 肝细胞中Orai1对NEFA诱导氧化应激的影响
        3.3.2 肝细胞中Orai1对NEFA诱导线粒体损伤的影响
        3.3.3 肝细胞中Orai1对NEFA诱导内质网应激的影响
        3.3.4 钙离子对线粒体损伤的影响
4 讨论
    4.1 Orai1对NEFA诱导的犊牛肝细胞氧化应激与线粒体损伤的影响
    4.2 Orai1对NEFA诱导的犊牛肝细胞内质网应激的影响
    4.3 Orai1对NEFA诱导犊牛肝细胞氧化应激与内质网应激关系的影响
5 结论
参考文献
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]垦区规模牛场奶牛脂肪肝流行病学调查与分析[J]. 史文军,林为民,李留江,黄新.  养殖与饲料. 2018(05)
[2]奶牛脂肪肝的诊断及监测[J]. 郝宁,邹苏萍,陶焕青,明鹏飞,徐怡钟,聂星灿,冯士彬,王希春,吴金节,李玉.  生物学杂志. 2018(01)
[3]钙离子依赖的内质网应激在细胞凋亡中作用研究进展[J]. 张玉静,钟才高.  中国职业医学. 2017(03)
[4]内质网钙池操控钙内流研究进展[J]. 郑思思,项楠,赵福宽.  生物技术进展. 2017(02)
[5]内质网应激与疾病[J]. 陈娜子,姜潮,李校堃.  中国生物工程杂志. 2016(01)
[6]Bedside ultrasound in the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease[J]. Nancy Khov,Amol Sharma,Thomas R Riley.  World Journal of Gastroenterology. 2014(22)
[7]内质网应激与肝脏疾病研究进展[J]. 王洪岩,刘晓珺,杜雅菊,赵磊.  世界华人消化杂志. 2012(06)
[8]内质网应激与肝脏损伤的治疗[J]. 黄啸,周植星,段为钢,江振洲,孙丽新,张陆勇.  现代药物与临床. 2011(03)

硕士论文
[1]基于比较优势理论的中国奶牛养殖产业布局研究[D]. 李萌.东北农业大学 2019
[2]奶牛脂肪肝综合诊断指标的筛选及氧化应激对犊牛肝脏线粒体OCT活性的影响[D]. 王明琼.西北农林科技大学 2015
[3]围产期奶牛血中某些生化指标与脂类代谢病关系的研究[D]. 薛瑞益.内蒙古农业大学 2006



本文编号：3206683