两株狂犬病病毒全基因组序列测定及aG株反向遗传操作系统的建立

发布时间：2021-05-27 08:04

　　狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus, RV）感染引起的侵害中枢神经系统的人兽共患病，一旦发病，致死率几乎为100%。目前疫苗接种是预防狂犬病的主要措施之一。狂犬病病毒aG株是我国狂犬病人用疫苗毒株，其病毒全基因组序列尚未报道，因此该病毒的基因组结构、基因组组成特点、病毒与其它毒株之间的亲缘关系远近关系等尚不清楚。本研究选择aG毒株作为研究对象，在对其进行了全基因组序列的测定以及特征分析的基础上，完成了病毒全长cDNA以及构成病毒核糖核蛋白复合物的3个辅助质粒构建，通过共转染BHK-21细胞建立了该毒株的反向遗传学操作系统，主要研究成果如下：1．首次对狂犬病病毒aG毒株全基因组序列进行了测定，并将其基因组序列与Genbank中收录的其它狂犬病病病毒疫苗株进行了比对分析，其结果显示，aG株全长为11925nt，基因组包含5个完整的开放阅读框，分别编码核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、糖蛋白（G）以及转录大蛋白（L）。基因组3′端前导序列和5′末端序列长度分别为58bp和70bp。基因间隔区长度分别为2bp、5bp、5bp以及24bp，基因组两端的11个... 

【文章来源】：中国农业科学院北京市

【文章页数】：112 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
英文缩略表
第一章 绪论
    1.1 研究背景
    1.2 研究现状
        1.2.1 传统弱毒疫苗和灭活疫苗
        1.2.2 基因工程亚单位疫苗
        1.2.3 基因工程重组活载体疫苗
        1.2.4 DNA 疫苗
        1.2.5 反向遗传学弱毒苗
        1.2.6 其它疫苗
    1.3 研究的目的和意义
第二章 RV aG 毒株全基因组序列测定及生物信息学分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 病毒
        2.1.3 菌种与载体
        2.1.4 试剂盒与仪器
        2.1.5 引物设计
        2.1.6 病毒全基因组 RNA 的提取
        2.1.7 cDNA 的合成
        2.1.8 目的片段的 PCR 扩增
        2.1.9 PCR 扩增产物的回收
        2.1.10 PCR 产物与 pMD-18-T simple 载体连接
        2.1.11 连接产物的转化
        2.1.12 菌落的筛选与鉴定
        2.1.13 质粒 DNA 的小量制备
        2.1.14 质粒的鉴定
        2.1.15 病毒基因组末端序列的测定
        2.1.16 序列比对与分析
        2.1.17 G 基因和 N 基因的生物信息学分析
    2.2 结果
        2.2.1 aG 毒株基因组扩增与基因组结构
        2.2.2 aG 毒株基因组末端扩增
        2.2.3 aG 毒株核苷酸特点
        2.2.4 aG 毒株结构蛋白结构特点
        2.2.5 aG 毒株 N 基因的系统进化分析
        2.2.6 aG 毒株 G 基因和 N 基因的生物信息学分析
    2.3 讨论
    2.4 小结
第三章 狂犬病病毒 CVS-24 株全基因组测序及生物信息学分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 病毒
        3.1.2 菌种与载体
        3.1.3 试剂盒与仪器
        3.1.4 引物设计
        3.1.5 病毒全基因组 RNA 的提取
        3.1.6 cDNA 的合成
        3.1.7 目的片段的 PCR 扩增
        3.1.8 PCR 扩增产物的回收
        3.1.9 PCR 产物与 pMD18-T simple 载体连接
        3.1.10 连接产物的转化
        3.1.11 菌落的筛选与鉴定
        3.1.12 质粒 DNA 的小量制备
        3.1.13 质粒的鉴定
        3.1.14 病毒基因组末端序列的测定
        3.1.15 序列比对与分析
        3.1.16 G 蛋白与 N 蛋白的生物信息学分析
    3.2 结果
        3.2.1 CVS-24 毒株全基因组扩增与基因组结构
        3.2.2 基因组两端扩增
        3.2.3 G 蛋白和 N 蛋白的生物信息学分析
    3.3 讨论
    3.4 小结
第四章 RV aG 毒株全长 cDNA 的设计与构建
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 病毒总 RNA 的提取
        4.1.3 引物设计
        4.1.4 cDNA 的合成
        4.1.5 目的片段的 PCR 扩增
        4.1.6 PCR 扩增产物的回收
        4.1.7 PCR 产物与 pMD-18-T simple 载体连接
        4.1.8 连接产物的转化
        4.1.9 菌落的筛选与鉴定
        4.1.10 质粒 DNA 的小量制备
        4.1.11 重组质粒的鉴定
        4.1.12 aG 毒株全长 cDNA 重组真核表达质粒的构建
    4.2 结果
        4.2.1 病毒全长基因组分段扩增结果
        4.2.2 克隆载体的酶切鉴定
        4.2.3 重组真核表达载体的酶切鉴定
    4.3 讨论
    4.4 小结
第五章 RV aG 株辅助质粒的设计与构建
    5.1 材料与方法
        5.1.1 材料
        5.1.2 病毒总 RNA 的提取
        5.1.3 引物设计
        5.1.4 cDNA 的合成
        5.1.5 目的片段的 PCR 扩增
        5.1.6 PCR 扩增产物的回收
        5.1.7 PCR 产物与 pMD-18-T simple 载体连接
        5.1.8 连接产物的转化
        5.1.9 菌落的筛选与鉴定
        5.1.10 质粒 DNA 的小量制备
        5.1.11 重组质粒的鉴定
        5.1.12 aG 株辅助重组真核表达质粒的构建
    5.2 结果
        5.2.1 各基因 PCR 扩增结果
        5.2.2 携带目的基因的 T 载体酶切验证
        5.2.3 表达 N、P、L 蛋白的哺乳动物表达载体构建
    5.3 讨论
    5.4 小结
第六章 RV aG 毒株反向遗传操作系统的初步建立
    6.1 材料
        6.1.1 细胞
        6.1.2 主要试剂
    6.2 方法
        6.2.1 包含有全长 cDNA 以及辅助质粒的细菌的大量培养
        6.2.2 无内毒素质粒提取
        6.2.3 转染细胞的准备
        6.2.4 转染拯救重组病毒
        6.2.5 拯救病毒的鉴定
    6.3 结果
        6.3.1 RT-PCR 检测结果
        6.3.2 重组病毒毒力检测
    6.4 讨论
    6.5 小结
第七章 全文总结
参考文献
致谢
作者简历
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]表达狂犬病毒糖蛋白抗原的重组犬2型腺病毒的构建及鉴定[J]. 赵忠鹏,夏咸柱,扈荣良,谢之景,闫芳,黄耕,杨松涛.  微生物学报. 2007(02)



本文编号：3207216