犬冠状病毒JS1706株M基因的分子特性与真核表达

发布时间：2021-06-07 01:03

　　为了解犬冠状病毒（CCV）江苏分离毒株（JS1706）M基因的分子特性,对其全序列进行了扩增和序列分析。结果表明,该基因ORF全长为792 bp,编码263个氨基酸。与CCV参考毒株（I型和II型）进行核苷酸和氨基酸同源性比较,其同源性分别为86.3%～98.7%,88.2%～99.2%。进化树分析表明,JS1706株与CCVⅡ型国内流行株NJ17、NTU 366共属一个分支。生物信息学分析表明,M蛋白有一个17个氨基酸构成的信号肽区域,3个跨膜区和3个N-糖基化位点。根据基因序列推测M蛋白的分子量为29 823。将扩增得到的M基因全序列片段经纯化后与载体pCDNA3.1连接,构建了pCDNA3.1CCV-M真核表达质粒,在293T细胞上能成功表达。本研究结果不仅有助于了解国内CCV的M基因分子特性,也为CCV分子快速诊断和疫苗研究奠定了基础。 

【文章来源】：畜牧与兽医. 2020,52(04)北大核心

【文章页数】：5 页

【部分图文】：

CCV JS1706株M基因的PCR扩增

根据基因序列推测的M蛋白相对分子质量为29 823,理论pI值为 8.71。用SingalP4. 1 在线程序预测该蛋白的信号肽结果显示,M蛋白仅有一个信号肽区域,氨基酸位置为1～17;利用NetNGlyc 1.0 Server在线程序预测M蛋白的糖基化位点,结果显示,该蛋白N糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr)有3个,氨基酸和位置分别为33NGT,56NFS,252NLS;利用 TMHMM2.0在线程序预测该毒株M蛋白的跨膜区有3个,氨基酸位置为48～70,77～99,114～136。2.5 真核表达质粒构建

分别以表1中所列引物,质粒pcDNA3.1以及病毒cDNA为模板PCR扩增出CCV的M基因以及线性化载体;PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后可见特异性条带,pcDNA3.1载体约为5 000 bp,片段约为792 bp;大小与预期相符(见图3A)。切取含目的基因的凝胶,分别回收纯化后,用重组酶Exnase TM Ⅱ进行快速克隆。连接产物转化大肠杆菌DH5α,挑取4个单个菌落,用pCDNA3.1载体的正向引物进行菌液PCR扩增,产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后,该4个菌落都可扩出特异性条带,其大小与预期结果相符(见图3B)。经质粒制备与序列测定后,将CCV的M基因阳性重组质粒命名为pcDNA3.1-CCV-M。2.6 CCV-M质粒的真核表达鉴定

【参考文献】：
期刊论文
[1]犬冠状病毒TN449株M基因的克隆与转移载体的构建[J]. 张建武,王权,李健,胡永强,吕彩云,陈燕军,薛飞群,林矫矫.  中国兽医科技. 2005(08)
[2]犬冠状病毒在我国首次分离成功[J].   中国兽医学报. 1996(01)



本文编号：3215520