CRISPR/Cas9系统介导羊MSTN基因敲除和定点整合fat-1基因的研究

发布时间：2021-06-09 11:31

　　提高家畜产肉性能,培育高产优质的肉用家畜新品种是育种工作的目标之一,通过基因编辑技术可以快速改变特定基因组成,获得需要的优良性状。MSTN基因为骨骼肌生长的负调控因子,该基因的突变会导致动物肌肉发达、体重增加；fat-1基因编码ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,可以将多不饱和脂肪酸从ω-6转化为ω-3形式,fat-1基因的增加有利于提高动物体内ω-3的含量。本研究利用最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了敲除山羊MSTN基因的同时在该位点插入fat-1基因的gRNA载体和fat-1基因定点敲入载体,利用电转法将载体转入绒山羊胎儿成纤维细胞中,筛选阳性单克隆细胞,通过体细胞克隆的方法生产转基因绒山羊,期望培育出在提高羊肉产量的同时增加羊肉中ω-3含量的家畜新品种。1、载体的构建本实验成功构建了2对基于MSTN基因一号外显子的gRNA表达载体,通过Survery酶切突变检测gRNA2突变效率高于gRNA1;同时成功构建了含有fat-1外源基因且可以定点整合至宿主基因组MSTN位点的敲入载体5’h-pCAGD NA3-fat-1-3’h。2、转基因单克隆细胞系的筛选本实验使用电转法将线性化... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一部分：实验部分
    第一章：载体的构建
        1 材料
            1.1 主要仪器设备
            1.2 实验材料和试剂
        2 方法
            2.1 CRISPR/Cas9表达载体的构建和效率检测
            2.2 敲入载体fat-1(5’h-pCAGDNA3-fat-1-3’h)的构建
        3 结果
            3.1 CRISPR/Cas9系统的优化和sgRNA表达载体的构建
            3.2 Surveyor突变检测结果
            3.3 敲入载体fat-1(5’h-pCAGDNA3-fat-1-3’h)的构建
        4. 讨论
            4.1 CRISPR/Cas9介导的基因编辑
            4.2 敲入载体5’h-pCAGDNA3-fat-1-3’h载体的构建
        参考文献
    第二章 CRISPR/Cas9介导的MSTN基因敲除同时定点整合外源基因fat-1单克隆细胞的筛选
        1. 材料
            1.1 主要仪器设备
            1.2 化学试剂与耗材
            1.3 实验材料
        2 方法
            2.1 电穿孔法转染GEFs
            2.2 单克隆细胞系的挑选
            2.3 基因修饰细胞系的鉴定
        3 结果
            3.1 转基因单克隆细胞系的筛选
            3.2 转基因细胞的鉴定
        4 讨论
        参考文献
    第三章 核移植技术制备转基因阿尔巴斯绒山羊
        1 材料
            1.1 化学试剂与实验材料
            1.2 主要仪器设备
        2 方法
            2.1 供体细胞的制备
            2.2 受体卵母细胞的收集和体外成熟培养
            2.3 卵子去核和体细胞核移植
            2.4 体细胞和去核卵母细胞的融合
            2.5 重构胚的激活
            2.6 重构胚胎的体外培养
            2.7 克隆胚胎移植
            2.8 妊娠检查
            2.9 转基因羊的接产
        3 结果
            3.1 供体细胞的制备
            3.2 卵母细胞的采集与成熟培养
            3.3 重构胚的构建及融合
            3.4 重构胚的体外培养及移植
            3.5 克隆胚胎移植及妊娠检查
            3.6 转基因羊的接产及鉴定
        4 讨论
        参考文献
    结论
第二部分 综述部分
    1 CRISPR/Cas技术概述
        1.1 CRISPR/Cas的研究历史
        1.2 CRISPR/Cas的结构
        1.3 CRISPR/Cas9技术介导基因组靶向修饰的作用机理
    2 CRISPR/Cas9技术在哺乳动物转基因中的应用
        2.1 CRISPR/Cas9技术在制备转基因敲除动物中的应用
        2.2 CRISPR/Cas9技术在制备转基因敲入动物中的应用
        2.3 CRISPR/Cas9技术在制备转基因动物时的优、缺点
    3 展望
    参考文献
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]一种新的由CRISPR/Cas系统介导的基因组靶向修饰技术[J]. 刘思也,夏海滨.  中国生物工程杂志. 2013(10)
[2]CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展[J]. 李辉,施振旦.  江苏农业学报. 2013(04)
[3]肌肉生长抑制素基因在不同动物中的研究进展[J]. 李盈,额尔敦木图,刘图雅,伊特格勒图,沙日扣,图雅.  中国畜牧兽医. 2013(08)
[4]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇.  生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[5]不同激活方法对绒山羊卵母细胞孤雌发育的影响[J]. 金永,袁建龙,朱兵,郭旭东,刘东军.  农业生物技术学报. 2011(03)
[6]双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定[J]. 李军华,韩翠芹,邓捷,王华岩.  生物工程学报. 2010(12)
[7]体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究[J]. 刘凤军,张玉玲,杨自军,陈兴启,孙达权,王国华,张涌.  安徽农业科学. 2008(29)
[8]一种新的双元表达质粒pCMV-Myc-IRES-EGFP的构建及其表达[J]. 严飞,赵新宇,邓洪新,魏于全.  生物工程学报. 2007(03)
[9]不同供体细胞及其处理对猪核移植重构胚体外发育的影响[J]. 张德福,刘东,汤琳琳,王英,陈茵,王凯,王根林,KARL Schellander.  遗传. 2007(02)
[10]牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附法分离培养与电穿孔法基因转染[J]. 杨东山,杜晨光,高飞,旭日干.  动物学研究. 2006(01)

博士论文
[1]ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究[D]. 赵宇航.内蒙古大学 2014
[2]牛体细胞克隆中异常重编程的分析及提高重编程效率的研究[D]. 苏建民.西北农林科技大学 2012
[3]转fat-1基因体细胞克隆绵羊的研究[D]. 张东.内蒙古农业大学 2011
[4]牛体细胞克隆中供体和受体细胞制备及重构胚构建的影响因素研究[D]. 高国龙.华中农业大学 2007

硕士论文
[1]CRISPR-Cas9技术介导阿尔巴斯白绒山羊MSTN基因敲除的研究[D]. 刘健.内蒙古大学 2015
[2]Edar基因敲除绒山羊胎儿成纤维细胞系的构建[D]. 郝斐.内蒙古大学 2013



本文编号：3220501