H1亚型禽流感病毒分离鉴定、遗传进化分析及快速检测方法的研究

发布时间：2021-06-10 23:37

　　禽流感病毒（AIV）以水禽为主要宿主,以其分类亚型众多、基因变异率高的特点在自然界广泛存在和传播。当中的H1亚型AIV属于低致病性A型流感病毒,但其产生的危害也不容忽视。已有大量报道表明,H1亚型AIV不仅能够在禽类中传播,也可以跨越种间屏障感染哺乳动物（如人、猪、马等）。因此,为了了解广西地区H1亚型AIV的生态流行趋势,掌握其遗传进化特点以及与猪源和人源H1亚型流感病毒各基因的联系和差异,同时为基层临床和实验室提供快速、有效的分子生物学检测方法,本研究对H1亚型AIV进行分离、鉴定、全基因测序、遗传进化分析以及临床快速检测方法的建立。本研究从2011年至2012年活禽市场采集的棉拭子样品中,首先通过血清学试验进行初步筛选、分离与纯化,并应用H1亚型AIV的二温氏PCR检测方法进一步确认,最后进行HA基因和NA基因的序列测定。两年间,本研究在不同的宿主（鸡、鸭、鸟）体内共分离、纯化得到了6株H1亚型AIV,并对其进行生物学特性确定这6株广西H1亚型AIV分离株均属于低致病性AIV。通过对6株H1亚型AIV的八个基因片段的全基因序列测定,将其序列测定结果与NCBI-GenBank上的序... 

【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校

【文章页数】：119 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
前言
第一章 文献综述
    1.1 禽流感病毒的国内外研究进展
        1.1.1 禽流感病毒流行历史概况
        1.1.2 禽流感病毒基因组结构和作用机制
        1.1.3 禽流感病毒的复制
        1.1.4 禽流感病毒抗原变化
        1.1.5 禽流感病毒的感染途径和方式
    1.2 H1亚型流感病毒的研究进展
    1.3 禽流感病毒快速诊断方法的研究进展
        1.3.1 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)
        1.3.2 二温式-聚合酶链式反应
        1.3.3 巢氏-聚合酶链式反应
        1.3.4 实时荧光定量-聚合酶链式反应
        1.3.5 多重-聚合酶链式反应
    1.4 本课题研究意义
第二章 H1亚型禽流感病毒的分离鉴定和生物学特性研究
    摘要
    2.1 材料与方法
        2.1.1 材料
        2.1.2 方法
    2.2 结果
        2.2.1 病毒分离结果
        2.2.2 病毒纯化
        2.2.3 RT-PCR检测鉴定结果
        2.2.4 HA基因和NA基因测序结果
        2.2.5 H1亚型禽流感病毒病原性监测情况
        2.2.6 鸡胚半数致死量(ELD_(50))和鸡胚半数感染量(EID_(50))的测定结果
        2.2.7 致病性实验结果
    2.3 讨论
第三章 6株H1亚型禽流感病毒全基因序列测定与分析
    摘要
    3.1 材料和方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 方法
    3.2 结果
        3.2.1 6株分离株全基因RT-PCR扩增结果
        3.2.2 各毒株基因片段的克隆和序列测定
        3.2.3 6株H1N2亚型禽流感病毒全基因序列分析
    3.3 讨论
第四章 H1亚型禽流感病毒快速检测方法的建立
    试验一 H1亚型禽流感病毒二温式PCR检测方法的建立
        摘要
        4.1 材料与方法
            4.1.1 病毒株
            4.1.2 主要试剂
            4.1.3 引物设计与合成
            4.1.4 病毒RNA抽提与反转录
            4.1.5 二温式PCR条件的优化
            4.1.6 二温式PCR的特异性试验
            4.1.7 二温式PCR的敏感性试验
            4.1.8 临床样品检测
        4.2 结果
            4.2.1 二温式PCR反应条件的优化
            4.2.2 特异性试验结果
            4.2.3 敏感性试验结果
            4.2.4 临床样品检测结果
        4.3 讨论
    试验二 H1亚型禽流感病毒巢氏PCR检测方法的建立
        摘要
        4.1 材料与方法
            4.1.1 毒株
            4.1.2 试剂
            4.1.3 引物设计与合成
            4.1.4 病毒RNA的抽提与反转录
            4.1.5 巢氏PCR条件的优化
            4.1.6 巢氏PCR的特异性试验
            4.1.7 巢式PCR的敏感性试验
        4.2 结果
            4.2.1 巢氏PCR条件优化结果
            4.2.2 特异性试验结果
            4.2.3 敏感性试验结果
        4.3 讨论
    试验三 H1亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立
        摘要
        4.1 材料与方法
            4.1.1 病毒株
            4.1.2 主要设备和试剂
            4.1.3 引物的设计与合成
            4.1.4 病毒RNA抽提与反转录
            4.1.5 标准品的制备
            4.1.6 反应条件的优化
            4.1.7 标准曲线的制作
            4.1.8 特异性试验
            4.1.9 敏感性试验
            4.1.10 重复性试验
            4.1.11 临床样品检测
        4.2 结果
            4.2.1 质粒DNA浓度的测定
            4.2.2 实时荧光定量PCR条件优化
            4.2.3 标准曲线的制作
            4.2.4 敏感性试验结果
            4.2.5 特异性试验结果
            4.2.6 重复性试验结果
            4.2.7 临床检测结果
        4.3 讨论
    试验四 H1和H3亚型禽流感病毒二重PCR检测方法的建立
        摘要
        4.1 材料与方法
            4.1.1 试剂
            4.1.2 毒株
            4.1.3 引物设计与合成
            4.1.4 病毒RNA抽提与反转录
            4.1.5 二重PCR扩增条件的优化
            4.1.6 二重PCR的特异性试验
            4.1.7 二重PCR的敏感性试验
            4.1.8 临床样品检测
        4.2 结果
            4.2.1 二重PCR条件的优化
            4.2.2 特异性试验结果
            4.2.3 敏感性试验结果
            4.2.4 临床样品检测结果
        4.3 讨论
    试验五 H1、H3亚型禽流感病毒和M基因三重RT-PCR检测方法的建立
        摘要
        4.1 材料与方法
            4.1.1 试验材料
            4.1.2 引物设计与合成
            4.1.3 病毒RNA抽提与反转录
            4.1.4 阳性质粒的制备
            4.1.5 三重PCR扩增条件的优化
            4.1.6 三重PCR的特异性试验
            4.1.7 三重PCR的敏感性试验
            4.1.8 临床样品检测
        4.2 结果
            4.2.1 三重PCR条件的优化结果
            4.2.2 特异性试验结果
            4.2.3 敏感性试验结果
            4.2.4 临床样品检测结果
        4.3 讨论
第五章 H1亚型禽流感病毒多种快速检测方法的比较
    摘要
    5.1 材料与方法
        5.1.1 病毒株
        5.1.2 RNA的抽提
        5.1.3 病毒RNA的梯度稀释
        5.1.4 病毒RNA浓度的测定
        5.1.5 RNA的反转录
        5.1.6 引物的合成
        5.1.7 六种检测方法的最佳扩增条件
    5.2 结果
        5.2.1 病毒RNA敏感性检测结果
    5.3 讨论
结论
参考文献
致谢
个人简历
攻读学位期间发表论文情况



本文编号：3223336